外周血單個核的細胞中糖皮質(zhì)激素受體亞型與突發(fā)性聾預(yù)后的相關(guān)性△

戴艷紅 陸玲 吳骎 袁文杰 張秀玲 佘萬東

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)是治療突發(fā)性聾(sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)公認有效的藥物之一，它通過與胞漿中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達，發(fā)揮藥理作用。人類GR的主要生理存在形式是 GRα和GRβ，GRα可與GC結(jié)合，發(fā)揮抗炎、抑制免疫等生物學作用，GRβ不能與GC結(jié)合，被認為是GRα的內(nèi)源性抑制因子，故GRβ增多可能是影響GC作用的重要因素[1]，進而影響GC治療SSNHL的療效。富含絲氨酸/精氨酸蛋白家族(serine/arginine-rich proteins,SR蛋白家族)成員SRp30c廣泛分布于全身各器官，在促進正常人中性粒細胞的GR pre-mRNA發(fā)生選擇性剪接形成編碼GRβ mRNA的過程中，使GRβ mRNA表達量增加[1]。為了探討GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA的表達量與聽力預(yù)后的相關(guān)性，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR,QRT-PCR)定量檢測了27例SSNHL患者應(yīng)用GC治療以后外周血單個核的細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA的表達量，并隨訪3～4個月，了解患者最終聽力恢復情況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 27例符合診斷標準[2]的SSNHL患者作為研究對象(突聾組)，其中男11例，女16例，年齡25～62歲，平均44.78±10.60歲。均為單耳發(fā)病，經(jīng)過純音測聽、聲導抗、聽性腦干反應(yīng)、耳聲發(fā)射、顳骨薄層CT或MRI檢查，排除了中耳、蝸后病變或有明確病因引起的感音神經(jīng)性聽力損失，無家族性耳聾病史。聽力正常無耳部疾病的鼻中隔偏曲志愿者6例為對照組，男4例，女2例，年齡20～49歲，平均34.50±9.71歲。

1.2治療方法 本項目獲得南大醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會的批準。突聾組根據(jù)患者意愿，給予中耳置管灌注甲潑尼龍[3，4]20例，靜脈注射甲潑尼龍治療7例，另外所有患者均全身應(yīng)用銀杏提取物、甲鈷銨、維生素B1等藥物治療。

1.3療效評定標準 突聾組于治療前和治療后3～4個月時分別行純音聽閾檢查。參照中華醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學會SSNHL療效評定標準(2005年)[2]，以治療前后受損頻率平均純音聽閾(pure-tone threshold average,PTA)改善值作為療效評估的依據(jù)，PTA改善<15 dB為無效，15～30 dB為有效，>30 dB為顯效，受損頻率恢復至正常、發(fā)病前水平或?qū)?cè)耳水平為痊愈。

1.4QRT-PCR法檢測PBMCs中GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA方法 突聾組患者中鼓室灌注GC前、治療后10天兩次抽取外周靜脈血15例，僅灌注GC前抽血5例；靜脈灌注GC治療者治療前、治療后10天分別抽血3例，僅在治療前抽血4例。對照組和突聾組患者均于早晨6:30抽取外周血20 ml，放入含有EDTA抗凝的試管中，密度梯度離心法分離外周血單個核的細胞(PBMCs)；取提取的PBMCs，按照Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度。根據(jù)Prime Script R-T reagent Kit試劑盒說明書，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)總體系10 ul，反應(yīng)條件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，cDNA產(chǎn)物置-20℃保存。

QRT-PCR法檢測目的基因，引物由Pri-mer5.0軟件自行設(shè)計。引物序列：GRα mRNA：上游5'-GAAGGAAACTCCAGCCAGAAC-3',下游5'-CTGATTGGTGATGATTTCAGCTA-3'；GRβ mRNA：上游5'- GAAGGAAACTCCAGCCAGAAC-3',下游5'- TGACTTATTATTGACAACGAAGTGC-3'；SRp30c mRNA：上游5'- TGTTTCAGGACTTCCTCCGTCAG-3',下游5'- AGGGCATATTCCATGTCTTCTTT-3'； β-actin mRNA：上游5'- TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游5'- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

PCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性30 sec，95 ℃變性5 sec，62 ℃退火/延伸20 sec，循環(huán)40次。擴增反應(yīng)結(jié)束后，立即進行融解曲線分析，判定是否有非特異性擴增產(chǎn)物的存在。分別計算 GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA 及β-actin mRNA的Ct值,兩者之差即為△Ct值，2-△Ct作為評價目的基因相對表達水平的指標。

1.5統(tǒng)計學方法 用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析。本組資料不符合正態(tài)分布，正文采用Mann-Whitney秩和檢驗、Wilcoxon帶符號秩檢驗和Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1突聾組聽力觀察結(jié)果 治療后隨訪3～4個月，突聾組27例患者中有效11例，顯效2例，痊愈2例，無效12例。將有效、顯效和痊愈者共15例納入有效組，無效者12例納入無效組進行GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表達量分析比較。

2.2有效組、顯效組、對照組GRα mRNA與GRβ mRNA表達量的比較 27例SSNHL患者中，有效組15例，10例在治療前后各抽血1次，5例僅治療前抽血1次(n=25)；無效組12例，8例治療前后各抽血1次，4例僅治療前抽血1次(n=20)。對照組6例，均取術(shù)前血樣本一次(n=6)。三組GRα mRNA表達水平均顯著高于GRβ mRNA(表1)，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各組GRα mRNA與GRβ mRNA表達量2-△Ct的比較

注：表中擴號前數(shù)據(jù)為中位數(shù)，擴號內(nèi)為四分位數(shù)；下表同

2.3各組GRβ mRNA與SRp30c mRNA表達量的相關(guān)性檢驗 本組共51份血標本GRβ mRNA與SRp30c mRNA的表達量存在顯著正相關(guān)性(r=0.492，P=0.000)。

2.4有效組、無效組與對照組治療前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表達量的比較 有效組、無效組、對照組治療前GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表達量以及GRα mRNA/GRβ mRNA比值見表2，三組間比較差異均無統(tǒng)計學意義。

表2 有效組、無效組與對照組治療前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表達量及GRα mRNA/GRβ mRNA比值比較

2.5治療前鼓室灌注GC的有效者與無效者，靜脈滴注GC治療的有效者和無效者GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表達量以及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比較 鼓室灌注GC治療的20例中，有效12例，無效8例，治療前有效者和無效者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表達量以及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比較，差異無統(tǒng)計學意義(表3)。靜脈滴注GC治療的7例中，有效3例， 無效4例，治療前有效者與無效者PMMCs中上述各項指標比較差異同樣均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 鼓室灌注GC治療有效與無效者治療前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表達量及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比較

2.6鼓室灌注GC有效者治療前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比較 鼓室灌注GC治療有效的12例中灌注前、后均抽血8例，這8例灌注后GRα mRNA和GRβ mRNA表達量下調(diào)，與灌注前相比差異有統(tǒng)計學意義(表4)，GRα mRNA/GRβ mRNA比值灌注后與灌注前相比也下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 鼓室灌注GC治療有效者治療前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比較(n=8)

2.7鼓室灌注GC無效者治療前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比較 鼓室灌注GC治療無效的8例中灌注前、后均抽血7例，該例灌注前GRα mRNA、GRβ mRNA表達和GRα mRNA/ GRβ mRNA比值與灌注后比較，差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 鼓室灌注GC治療無效者治療前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比較(n=7)

3 討論

SSNHL發(fā)病機制目前尚不十分清楚，一般認為與病毒感染、血管因素、自身免疫或代謝紊亂等不同病因有關(guān)，GC可抑制上述各種病因引起的內(nèi)耳炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)、維持內(nèi)外淋巴液的離子平衡[5,6]，在SSNHL的治療中被國內(nèi)外同行廣泛接受和認可[7]，被推薦為主要治療手段[5,8]。

在細胞水平GC通過與胞漿中的GR結(jié)合，激活的受體轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達，從而在靶器官發(fā)揮生物學效應(yīng)。人類GR基因經(jīng)選擇性剪接可生成五種亞型：GRα、GRβ、GRγ、GRp(即GRδ)及GRA[9]，其中GRα和GRβ是主要生理存在形式。這兩種GR蛋白N末端的前727位氨基酸相同，此區(qū)域包括DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄結(jié)合區(qū)；而C末端序列有所不同，這種不同導致GRα可與GC結(jié)合，而GRβ因無激素結(jié)合區(qū)不與GC結(jié)合；兩者均可與GC反應(yīng)元件(glucocorticoid responsive element,GRE)結(jié)合，但GRβ不能直接激活靶基因[10]。GR亞型依靠激素依賴模式通過模式轉(zhuǎn)換向靶組織傳遞激素信息，GRα是介導GC效應(yīng)的主要受體亞型，當兩種受體亞型存在于同一細胞時，GRβ抑制激素依賴性的GR誘導的基因表達，因此GRβ很可能是一種內(nèi)源性GR抑制劑。有報道認為[11]，在某些病理狀態(tài)下GRβ表達增加，在細胞中對GC反應(yīng)性起關(guān)鍵作用的是GRα/GRβ比值，高比例與GC敏感有關(guān)，而低比例與GC抵抗的發(fā)生有關(guān)。故本研究通過檢測SSNHL患者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA含量，計算GRα mRNA/ GRβ mRNA比值，隨訪SSNHL患者的聽力預(yù)后，分析GR亞型與GC治療SSNHL的敏感性及與聽力預(yù)后是否存在相關(guān)性。

正常情況下人體大多數(shù)細胞中GRα占主導地位，GRβ mRNA水平遠低于GRα mRNA，僅占總GR mRNA的0.12%～0.13%[1]，本組GC治療有效組、無效組和對照組中的GRα mRNA表達量均顯著高于GRβ mRNA，GRα mRAN占主導地位，且GRβ mRNA的表達量與SRp30c mRNA存在正相關(guān)，驗證了SRp30c可促進GR pre-mRNA發(fā)生選擇性剪接形成GRβ mRNA[1]。

全身給藥和鼓室灌注給藥后的GC需分別經(jīng)血迷路屏障和圓窗膜滲透進入內(nèi)耳，與內(nèi)耳組織細胞中的GR受體結(jié)合方能發(fā)揮抗炎、抑制免疫等生物學作用。然而，目前無法直接觀察SSNHL患者活體耳蝸組織細胞中的GR亞型。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[12]：GR mRNA與GR蛋白在豚鼠PBMCs和耳蝸組織中均有表達，且PBMCs中的GR mRNA、GR蛋白表達量與耳蝸組織中的表達量存在正相關(guān)。Kassner等[13]觀察了12例SSNHL患者外周血中的腫瘤壞死因子(tumor neorosis factor,TNF)、可溶性CD40(sCD40)以及特定表型的淋巴細胞，并與年齡匹配的健康對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)SSNH患者的促炎轉(zhuǎn)錄因子和炎癥介質(zhì)均較對照組明顯增高，表明外周循環(huán)中的炎性介質(zhì)和淋巴細胞能夠反映SSNHL患者內(nèi)耳的炎癥狀態(tài)。通過檢測外周循環(huán)中的炎癥因子、氧化應(yīng)激標記物以及PBMCs表達的促炎、促凋亡或促粘附因子等來研究SSNHL內(nèi)耳的發(fā)病機制是可行的[13,14]。

本研究采用QRT-PCR法檢測SSNHL患者PBMCs中GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表達量，并計算GRα/GRβ比值，結(jié)果顯示，治療前上述指標在有效組、無效組和對照組間均無統(tǒng)計學差異，即本組資料尚不能支持PBMCs中 GR亞型與SSNHL患者GC治療是否有效及聽力預(yù)后存在相關(guān)性，與李春林等[15]的研究結(jié)果不完全一致，他們采用RT-PCR的方法檢測SSNHL患者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA，同時給予口服醋酸潑尼松片及銀杏葉提取物注射液治療，結(jié)果GRβ mRNA在治療無效組明顯高于治療有效組和對照組，GRα/GRβ比值無效組明顯低于有效組和對照組。分析原因可能為：首先，GRβ亞型絕對數(shù)量或比值增高僅是GC抵抗(治療無效)的眾多分子機制之一，其他機制如遺傳因素所致的家族性GC抵抗、GR的磷酸化或硝基化修飾、促炎轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB、AP-1)增加、組蛋白乙?；惓５纫蛩豙16,17]可能更為重要，這些機制可能同時作用或某個機制起主要作用，相關(guān)的研究需要進一步深入；其次，本組樣本量偏少，不能根據(jù)SSNHL患者的聽閾曲線類型、聽力損失程度以及發(fā)病后開始治療的時間長短進行分組分析，也不能排除上述與SSNHL預(yù)后有關(guān)的其他因素的影響，重點觀察GR亞型與GC敏感性和聽力預(yù)后的相關(guān)性。

有文獻報道短期全身應(yīng)用大劑量地塞米松可使PBMCs與耳蝸組織中的GR mRNA、GR蛋白含量同步上調(diào)，長期使用GC則可導致GR的下調(diào)[18]；前期動物實驗結(jié)果[12]也觀察到，豚鼠短期全身應(yīng)用大劑量地塞米松可使PBMCs與耳蝸組織中的GR mRNA、GR蛋白含量同步上調(diào)。本研究分別比較了SSNHL患者鼓室灌注GC治療有效和無效者在灌注GC前后PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA表達和GRα mRNA/GRβ mRNA比值，結(jié)果在灌注GC治療有效者中，灌注后GRα mRNA和GRβ mRNA表達與灌注前相比下降，差異有統(tǒng)計學意義；而在灌注GC治療無效者中，灌注前后兩者的表達量差異無統(tǒng)計學意義。分析鼓室灌注GC治療有效的病例，GC能夠有效地經(jīng)圓窗膜滲透進入內(nèi)耳，抑制內(nèi)耳的炎癥反應(yīng)，內(nèi)耳炎癥狀態(tài)減輕，內(nèi)耳組織中的GRα mRNA和GRβ mRNA表達下調(diào)，進一步在外周循環(huán)的PBMCs中反映出來。

總之，SSNHL患者GC抵抗的機制可能是多方面的，本研究結(jié)果提示僅從治療前的單次GR亞型檢測尚不能預(yù)測SSNHL患者的GC治療效果，但治療后GRα mRNA和GRβ mRNA表達下調(diào)，可能提示良好的聽力預(yù)后，但還需積累病例、增加樣本量繼續(xù)研究。

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