人肺鱗癌組織中Caveolin-1的表達(dá)及預(yù)后意義*

馬華玲 陳洪雷 朱潤(rùn)慶 鄭明軍 劉毓玲 范克非 楊為貴

肺鱗癌占原發(fā)性肺癌1/3且有較差的預(yù)后，尋找與肺鱗癌預(yù)后有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)成為研究的熱點(diǎn)。Caveolin-1［1］參與了各種信號(hào)分子和通路的調(diào)控，它與細(xì)胞的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Li等［2］在肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但Caveolin-1與肺鱗癌預(yù)后的研究少見。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caveolin-1在人肺鱗癌、正常肺組織中的表達(dá)，分析其與人肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系；同時(shí)檢測(cè)PCNA在人肺鱗癌中的表達(dá)，分析Cavelin-1和PCNA的相關(guān)性，探討Caveolin-1表達(dá)在肺鱗癌中的預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源

收集武鋼總醫(yī)院1998年1月至2008年12月病理存檔蠟塊肺鱗癌43例，正常肺組織16例。入選條件：1）均診斷明確且病理資料及臨床隨訪資料完整；2）腫瘤分化程度，HE染色后由2名病理專家確診。

1.2 臨床資料

43例肺鱗癌中男36例，女7例；高分化18例，中分化12例，低分化13例；ⅠA+ⅠB期17例，ⅡA+ⅡB期10例，ⅢA+ⅢB期16例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；支氣管殘端有癌3例，支氣管殘端無(wú)癌40例。全部病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療。電話或門診隨訪患者出院后情況，隨訪至2011年12月；生存時(shí)間以月為單位。16例正常肺組織為距腫塊3 cm以上的肺組織。

1.3 主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

濃縮型兔多抗Caveolin-1購(gòu)自Santa Cruz公司，工作濃度為1∶100；即用型PCNA和超敏PV9000免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

Caveolin-1、PCNA抗原修復(fù)均采用微波修復(fù)，其余步驟嚴(yán)格按照PV-9000二步法說(shuō)明書進(jìn)行，用PBS代替一抗做空白對(duì)照；肺鱗癌陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

Caveolin-1以細(xì)胞質(zhì)/膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性；參照文獻(xiàn)［3］結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)弱評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：≤10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。染色強(qiáng)度分類：陰性，0分；弱，1分；中等，2分，強(qiáng)，3分。兩者計(jì)分相乘＞2分者為陽(yáng)性。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性；計(jì)數(shù)至少500個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率，陽(yáng)性率＞20%的為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)和精確概率法分析Caveolin-1、PCNA表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系，Caveolin-1與PCNA的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較組間的差異。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Caveolin-1、PCNA在人肺鱗癌中的表達(dá)

正常肺組織中Caveolin-1的陽(yáng)性表達(dá)位于肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，而支氣管黏膜上皮不表達(dá)（圖1A）；肺鱗癌組織中Caveolin-1的陽(yáng)性表達(dá)位于癌細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜內(nèi)（圖1B），并在分化好的鱗癌癌巢周邊基底樣細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于癌巢中央的細(xì)胞（圖1C）。43例肺鱗癌組織中Caveolin-1的陽(yáng)性率（44.19%）顯著低于16例正常肺組織（100%，P＜0.001）。PCNA的陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核（圖2），在人肺鱗癌中PCNA的陽(yáng)性率為53.49%（23/43）。

圖1 Caveolin-1的表達(dá)Figure1 Caveolin-1 expression in normal lung tissues and lung squamous cell carcinoma

圖2 PCNA在肺鱗癌中的表達(dá)（PV9000×200）Figure2 PCNA expression in lung squamous cell carcinoma（PV9000×200）

2.2 Caveolin-1的表達(dá)與人肺鱗癌病理特征的關(guān)系

Caveolin-1陽(yáng)性率隨臨床分期的上升而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）；Caveolin-1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.006）。Caveolin-1表達(dá)與肺鱗癌患者性別、年齡、分化程度、支氣管殘端有無(wú)癌殘留均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。Caveolin-1在PCNA（+）病例的陽(yáng)性率高于PCNA（-）病例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.360，P=0.018，表1）。

2.3 生存分析

2.3.1 Caveolin-1對(duì)人肺鱗癌患者生存預(yù)后的影響 患者隨訪至2011年12月，30例死亡，13例截尾。對(duì)Caveolin-1不同表達(dá)的肺鱗癌患者生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)顯示：Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者（P=0.007，圖3）。對(duì)24例Caveolin-1不同表達(dá)的無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者生存時(shí)間行Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)顯示：Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)的患者生存時(shí)間顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者（P=0.002，圖4）。對(duì)19例Caveolin-1不同表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者生存時(shí)間行Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)顯示：Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間與Caveolin-1陰性表達(dá)者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.333）。

2.3.2 單因素分析 單因素Cox生存分析結(jié)果顯示：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時(shí)間顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.008）；支氣管殘端有癌殘留的患者生存時(shí)間顯著低于支氣管殘端無(wú)癌殘留者（P＜0.001）；且隨患者TNM分期的升高，患者生存時(shí)間顯著下降（P=0.001）；PCNA表達(dá)陽(yáng)性的患者生存時(shí)間顯著低于PCNA表達(dá)陰性者（P=0.011）。而患者的性別、年齡及分化程度與肺鱗癌患者生存時(shí)間無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

2.3.3 多因素分析 將單因素分析中與患者生存時(shí)間相關(guān)的因素進(jìn)行多因素分析。結(jié)果顯示，Caveolin-1表達(dá)、TNM分期、支氣管殘端有無(wú)癌殘留是肺鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素；而患者淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、PCNA表達(dá)不是肺鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

表1 人肺鱗癌組織中Caveolin-1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例Table1 Relationship between Caveolin-1 expression and clinicopathological features in lung squamous cell carcinoma

圖3 43例肺鱗癌組織中Caveolin-1（+）組和Caveolin-1（-）組的生存曲線Figure3 Kaplan-Meier curves of 43 patients categorized into having Caveolin-1-positive and-negative expression

圖4 24例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中Caveolin-1（+）和Caveolin-1(-)組的生存曲線Figure4 Kaplan-Meier curves showing shorter survival times for Caveolin-1-positive than Caveolin-1-negative patients without lymph node metastasis

表2 多因素Cox統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table2 Results of Cox multivariate regression analysis

3 討論

Caveolin-1作為腫瘤抑制因子，其在肺癌［4］、乳腺癌［5］中表達(dá)下調(diào)，本研究亦發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在肺鱗癌組織中的表達(dá)顯著低于正常肺組織；導(dǎo)致Caveolin-1在肺鱗癌中失活的原因及途徑尚不清楚，可能與Caveolin-1突變、雜合性缺失、過(guò)甲基化有關(guān)［6］。本研究還發(fā)現(xiàn)正常肺組織中的支氣管黏膜和化生的鱗狀上皮中均不表達(dá)Caveolin-1，此結(jié)果提示肺鱗癌中Caveolin-1的表達(dá)與正常支氣管黏膜無(wú)關(guān)；具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。相對(duì)于正常肺組織而言，Caveolin-1在肺癌組織中總體表達(dá)下降，但本研究表明隨著肺鱗癌臨床分期的增高，Caveolin-1表達(dá)亦顯著增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Caveolin-1的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；這與Chen等［4］在肺癌中的報(bào)道一致。至于Caveolin-1在肺鱗癌中表達(dá)的雙面性，可能由于作為信號(hào)傳導(dǎo)樞紐的Caveolin-1作用比較復(fù)雜，蛋白表達(dá)量可能會(huì)表現(xiàn)出不同的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在分化好的肺鱗癌癌巢周邊基底樣細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于癌巢中央的細(xì)胞，該結(jié)果提示Caveolin-1可能通過(guò)癌巢外周的基底樣細(xì)胞與癌間質(zhì)細(xì)胞作用促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散。本研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1與PCNA的表達(dá)呈正相關(guān)。提示在肺鱗癌中Caveolin-1的異常表達(dá)可能亦通過(guò)刺激細(xì)胞增殖調(diào)控該腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

Caveolin-1參與細(xì)胞增殖、新生血管生成，與腫瘤預(yù)后相關(guān)［7］。Du等［8］對(duì)Caveolin-1不同表達(dá)的鼻咽癌患者生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)顯示：Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者。Ando等［9］對(duì)食管鱗癌的研究顯示Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者。本研究亦顯示Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者，提示Caveolin-1表達(dá)上調(diào)為腫瘤預(yù)后的不良因素；進(jìn)而對(duì)24例Caveolin-1不同表達(dá)的無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時(shí)間進(jìn)行生存分析顯示，Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)的患者生存期顯著低于Caveolin-1陰性表達(dá)者；對(duì)19例Caveolin-1不同表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時(shí)間進(jìn)行生存分析顯示，Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)與Caveolin-1陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果與Horiguchi等［10］在腎癌中的研究結(jié)果一致，提示Caveolin-1陽(yáng)性表達(dá)的原發(fā)性肺鱗癌有侵襲轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，Caveolin-1陽(yáng)性患者術(shù)后應(yīng)密切隨訪。對(duì)切除的肺鱗癌組織標(biāo)本進(jìn)行Caveolin-1檢測(cè)，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

單因素生存分析顯示，患者的生存時(shí)間與TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、PCNA狀態(tài)和支氣管殘端有無(wú)癌殘留有關(guān)。提示TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)和PCNA狀態(tài)相對(duì)于其它臨床病理因素而言對(duì)于肺鱗癌患者的預(yù)后具有更大的影響。手術(shù)的徹底性對(duì)于肺鱗癌患者的預(yù)后意義亦較大，故提倡手術(shù)治療肺鱗癌時(shí)應(yīng)盡最大可能的切除病灶。PCNA作為DNA聚合酶的輔助蛋白，能夠客觀地反映的惡性增殖分?jǐn)?shù)和生長(zhǎng)速度。研究［11］認(rèn)為PCNA在一定程度上反映腫瘤惡性程度，對(duì)于分析判斷腫瘤的預(yù)后有重要意義。多因素生存分析顯示，Caveolin-1表達(dá)、TNM分期、支氣管殘端有無(wú)癌殘留是影響肺鱗癌患者生存時(shí)間的顯著因素，該結(jié)果與Cho等［12］在上尿路移行細(xì)胞癌的研究結(jié)果類似。因此，本研究認(rèn)為Caveolin-1表達(dá)、TNM分期和支氣管殘端有無(wú)癌殘留可作為判斷肺鱗癌的預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，Caveolin-1參與與細(xì)胞惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達(dá)水平與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著密切的關(guān)系。Caveolin-1有可能成為指導(dǎo)肺鱗癌診斷和判斷預(yù)后的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)。

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