維吾爾族婦女宮頸癌與TFPI-2基因啟動區(qū)甲基化關(guān)系研究*

阿比班·阿克拉 阿比達(dá)·阿布都卡德爾 阿布力孜·阿布杜拉

人組織因子途徑抑制物2，是一種Kunitz型蛋白酶抑制劑，可抑制降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種蛋白酶［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，組織因子途徑抑制物2（TFPI-2）常表達(dá)缺失［2］?；騿幼痈呒谆饕l(fā)生在基因啟動子區(qū)域CpG小島，不改變蛋白質(zhì)編碼序列，但可以使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)失活，產(chǎn)生一系列基因的沉默［3］。近年來，DNA甲基化與宮頸癌的研究取得了巨大的進(jìn)展，已有文獻(xiàn)報道TFPI-2是宮頸癌相關(guān)基因的甲基化候選基因之一，從表觀遺傳學(xué)研究分析，TFPI-2基因的啟動子甲基化修飾必然引起該基因轉(zhuǎn)錄水平下降［4］。新疆南部地區(qū)屬我國子宮頸癌高發(fā)區(qū)之一，該地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌患病率及死亡率高，發(fā)病率比同一地區(qū)漢族婦女高3～4倍，病死率在全國少數(shù)民族中占第一位［5-6］，但是目前國內(nèi)有關(guān)TFPI-2在宮頸癌中的研究報道并不多見。本研究應(yīng)用MassARRAY甲基化DNA定量分析方法和半定量RT-PCR方法，研究維吾爾族婦女宮頸病變與TFPI-2基因啟動子甲基化的關(guān)系，探討該基因與宮頸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，為維吾爾族子宮頸癌生物標(biāo)志譜體系的建立、腫瘤的預(yù)測、綜合防治及預(yù)后判斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本來源及分組：收集2008年7月至2009年4月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和第三附屬腫瘤醫(yī)院婦科收治的維吾爾族婦女宮頸病變患者的手術(shù)切除或活檢新鮮組織標(biāo)本，其中宮頸癌（CSCC）患者25例，宮頸內(nèi)瘤變CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ患者14例和宮頸炎（CV）患者17例；為了制備組織RNA和半定量RT-PCR鑒定，收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科在2011年9月至2012年2月收治的患者手術(shù)切除或活檢新鮮組織標(biāo)本共71例，包括CV25例，CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ22例和CSCC 24例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理診斷，年齡30～60歲，平均40歲，術(shù)前未接受放射治療、化療或免疫治療，無合并或繼發(fā)第二癌，臨床資料完整。

1.2 試劑和儀器

試劑：蛋白酶K由美國Sigma公司提供，酚/氯仿、異丙醇、乙醇以及DEPC-treated water均購自上海生工，TRIzol總RNA提取試劑和Agarose瓊脂糖粉是美國Invitrogen公司產(chǎn)品，cDNA合成試劑盒和，定量PCR試劑（Fermentas公司）。主要儀器有高速低溫離心機（Allegra-64R，Beckmann Coulter）、核酸/蛋白快速測定儀（GeneQuant-II GE公司、德國），核酸凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-XR，Biorad），MassARRAY Compact System，梯度PCR儀（ABI9902，ABI美國）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析1）DNA制備及亞硫酸氫鹽修飾：取30～100 mg冷凍組織標(biāo)本，在液氮速凍狀態(tài)下研磨粉碎后，加入細(xì)胞裂解液（5 mmol Tris-HCL，1 mmol EDTA，0.5%SDS，100 mmol NaCl），37℃ 1 h。后加蛋白酶 K，56℃過夜。次日采用經(jīng)典的酚氯仿法抽提基因組DNA。經(jīng)DNA定量和純度測定，并以瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠（替代品）顯色和紫外成像予以質(zhì)檢。取0.75～1 μg組織DNA，采用亞硫酸氫鹽修飾專用試劑處理，其具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書。2）PCR引物設(shè)計：利用 EpiDesigner設(shè) 計 軟 件（http：//www.epidesigner.com，北京博奧生物有限公司）完成特定基因啟動子區(qū)CpG片段掃描及特異性PCR引物設(shè)計，其引物序列不含任何CpG位點，擴(kuò)增片段大小限制在200～600 bp。為了保證PCR產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在反向引物5'-末端整合T7-啟動子序列（cagtaatacgactcact atagggagaaggctACTTACAAATTTCCCATTACTAAAAA，小寫字母所示），在正向引物5'-末端增加10 bp Tag（aggaagagagAGTTTGAGGGGTGGTTGATTTAT），以平衡PCR反應(yīng)。3）PCR擴(kuò)增及體外轉(zhuǎn)錄：以亞硫酸氫鹽修飾的組織DNA為模板，運用384孔板和7 μL/孔反應(yīng)體系，經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增目的基因片段后，加入堿性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）處理游離核苷酸。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，加入Clean resin，混勻離心后備用（PCR Mass CLEAVE Reagent試劑盒美國SEQUENOM公司提供）。4）甲基化DNA定量分析：依托Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析技術(shù)平臺（北京博奧生物公司），按照自動化分析操作規(guī)程完成所有分析步驟，其中每一孔22 μL體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cRNA）自動裝入基質(zhì)的芯片（Spectro-CHIPs；Sequenom，SanDiego），運用MassARRAY質(zhì)譜儀（Bruker-Sequenom）收集質(zhì)譜圖，利用EpiTYPER軟件完成數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 半定量PCR檢測 1）采用TRIzol試劑、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法制備總RNA：所有試劑耗材均要求Dnase、Rnase-Free。取新鮮冷凍組織50～100 mg，在液氮冷凍狀態(tài)下碾碎，放入1.5 mL的Ep管中；加入1 mL TRIzol試劑，震蕩混勻，靜置10 min；12 000 rpm，4℃離心5 min，取上清至一新EP管；加200 μL氯仿，混勻，室溫放置2 min；12 000 rpm，4℃離心15 min后，液體呈現(xiàn)三相，小心吸取上清（約500 μL）置于新EP管，并加500 μL異丙醇充分混勻，室溫靜置10 min；將混合液12 000 rpm、4℃離心10 min后，管底可見白色沉淀（即為RNA）棄上清保留沉淀；加500 μL 75%酒精震蕩混勻后，12 000 rpm、4℃離心15 min，棄上清；12 000 rpm、4℃離心30 s，棄去殘余液體，空氣中干燥約10～15 min，沉淀以30 μL DEPC-treated water溶解沉淀，經(jīng)RNA定量和純度測定，并以瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠（替代品）顯色和紫外成像予以質(zhì)檢。-80℃保存待用。2）cDNA合成（逆轉(zhuǎn)錄）：按照試劑盒說明書合成cDNA（表1）。將上述混合液混勻，短暫離心后置于PCR儀上，65℃5 min后，取出立即置于冰上30 s，短暫離心。按照體系配置轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（表2）。將混合液混勻，短暫離心后置于PCR儀上42℃60 min，70℃ 5 min，4℃待機。合成的產(chǎn)物cDNA直接用作模板，或-20℃保存。

表1 cDNA主要合成成份及量Table1 Synthesis of the main ingredients and quantities

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Table2 Reverse transcription reaction system

1.3.3 RT-PCR檢測 1）引物的設(shè)計與合成：根據(jù)TFPI-2、GAPDH mRNA的Genbank數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計與合成其特異性引物（引物均由TAKARA公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測）。2）半定量RT-PCR：以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以不加模板的PCR體系為陰性對照，總體積25 μL（表3）。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 45 s，退火45 s，72℃延伸 1 min 30 s，72℃總延伸7 min，35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表3 半定量RT-PCR反應(yīng)體系Table3 Semiquantitative RT-PCR reaction system

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TFPI-2啟動子區(qū)CpG島片段甲基化水平研究

通過Genebank（NCBI）人類基因組計劃數(shù)據(jù)庫搜索，獲得了人類TFPI-2基因和mRNA序列（NG_044097和NM_006528），該基因定位于第7號染色體，含5個外顯子和4個內(nèi)含子。該數(shù)據(jù)庫提供的mRNA序列含1 203堿基，TFPI-2基因組序列含24 324 bp，其轉(zhuǎn)錄起始點位于第10 000 bp（啟動子區(qū)界點），而基因編碼序列長度為14 324 bp，編碼TFPI-2 RNA。應(yīng)用Methyl Primer Express專業(yè)軟件（ABI公司）對該基因的CpG島分布進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)一個較長的片段區(qū)域（-1 004～+995 bp），并設(shè)計出一對擴(kuò)增分析CpG片段的PCR引物，位于-329～-65 bp，CpG片段序列長度為263 bp。以此引物擴(kuò)增亞硫酸氫鹽修飾的組織DNA模板，獲得單一PCR產(chǎn)物，并已測序確認(rèn)（圖1）。

圖1 TFPI-2基因的典型DNA表達(dá)Figure1 Typical DNA expression map of the TFPI-2 gene

2.2 宮頸病變組織中TFPI-2啟動子區(qū)的總體CpG島片段甲基化水平分析

用t檢驗分析Sequenom MassArray質(zhì)譜數(shù)據(jù)，宮頸癌組TFPI-2基因CpG片段甲基化水平增加為0.168±0.152，以宮頸炎組為對照，宮頸內(nèi)瘤變組和宮頸癌之間進(jìn)行兩兩比較，宮頸炎組與CIN組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），而宮頸炎組和宮頸癌組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 宮頸病變組織中TFPI-2啟動子區(qū)CpG島的單一CpG位點甲基化水平分析

精確定位到基因片段每個CpG單位的甲基化狀態(tài)，用甲基化率量化每個CpG單位的甲基化程度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗?？梢婋S著病變發(fā)展該基因的單點甲基化水平逐漸增高，單點甲基化水平分析中，宮頸炎組與宮頸癌組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的甲基化位點有6個，分別為CpG_1，6，7，8，9和11等（P＜0.05，表4）。

表4 宮頸組織中TFPI-2基因單點甲基化水平分析Table4 TFPI-2 gene methylation analysis in cervical tissue

2.4 TFPI-2啟動子區(qū)CpG島中不同CpG位點相關(guān)性分析結(jié)果

為了明確每一個具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的甲基化位點之間是否有關(guān)聯(lián)性，利用CpG位點甲基化檢測數(shù)據(jù)，對不同CpG位點分析兩個位點相關(guān)性（表5），將兩個位點相關(guān)系數(shù)接近1（P＜0.01），為兩點之間相關(guān)性具有顯著性，相互之間有密切關(guān)聯(lián)性。

表5 TFPI-2基因甲基化單點相關(guān)性分析Table5 Single-point correlation analysis of TFPI-2 gene methylation

2.5 TFPI-2 mRNA表達(dá)水平與宮頸病變進(jìn)程的關(guān)系

內(nèi)參GAPDH引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物為138 bp（圖2），TFPI-2引物對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為440 bp（圖3），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證：擴(kuò)增片段長度和理論大小一致，且擴(kuò)增條帶單一，說明該引物有高度特異性。

在本研究所收集的病例標(biāo)本范圍內(nèi)，TFPI-2基因在宮頸炎轉(zhuǎn)錄水平的相對表達(dá)量為（0.456 4±0.201 8），伴隨著宮頸癌發(fā)病進(jìn)程角度分析，在CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ出現(xiàn)相對較低（0.398 8±0.321 3），在宮頸鱗癌組織內(nèi)繼續(xù)減少（0.262 3±0.217 8），而對總體mRNA表達(dá)水平進(jìn)行方差分析F值為8.330，P為0.001。再以宮頸炎為對照各組間分別兩兩比較發(fā)現(xiàn)除宮頸炎組和CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ組間差異不明顯外（P＞0.05），其他兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Figure2 GAPDH amplification agarose gel electrophoresis

圖3 TFPI-2擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Figure3 TFPI-2 amplification agarose gel electrophoresis

3 討論

TFPI-2基因位于7q22，其表達(dá)產(chǎn)物是光譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，在體外可強烈抑制纖溶酶、胰蛋白酶、金屬蛋白酶-l和金屬蛋白酶-3等［7-8］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性以及調(diào)控腫瘤細(xì)胞血管生長，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物功能。

體內(nèi)多種組織器官廣泛表達(dá)TFPI-2，而這些組織器官一旦發(fā)生腫瘤，TFPI-2的表達(dá)水平將隨之下降。有研究證明，TFPI-2在絨毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中表達(dá)水平下降可能與其啟動子區(qū)甲基化有關(guān)。除此以外，TFPI-2啟動子區(qū)的甲基化還與非小細(xì)胞肺癌和原發(fā)性胰腺導(dǎo)管癌有關(guān)［9］。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞基因組整體水平低甲基化和特定基因啟動子高度甲基化是已被公認(rèn)的腫瘤表觀遺傳學(xué)機制，其中基因啟動子區(qū)CpG島（富含CpG區(qū)域）甲基化引起的基因轉(zhuǎn)錄水平降低或基因休眠是腫瘤發(fā)病機制研究的重要切入點。而且越來越多研究表明，檢測腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，是一種很有前景的預(yù)測惡性腫瘤的生物標(biāo)記［10］。

TFPI-2是重要的宮頸癌腫瘤特異性高甲基化候選基因［4］，然而，對于TFPI-2宮頸病變組織特異性和CpG位點甲基化水平差異研究報道較少。本研究應(yīng)用MassARRY技術(shù)定量分析維吾爾族宮頸病變組織中該基因的甲基化水平。該研究平臺是一種堿基特異性酶切與MALDI-TOF分析結(jié)合的質(zhì)譜測序技術(shù)，選擇某一種基因啟動子區(qū)富含CG（CpG島嶼）片段，設(shè)計不含CpG的PCR引物，通過PCR擴(kuò)增、酶切和質(zhì)譜分析，輸出目標(biāo)片段的甲基化相關(guān)信息［11-12］。對TFPI-2基因CpG位點的目標(biāo)片段進(jìn)行了MassARRAY甲基化定量分析，獲得TFPI-2基因12 CpG位點的定量分析數(shù)據(jù)，對整體甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，宮頸炎組和CIN組之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但宮頸炎組和宮頸癌組間具有顯著性差異（P＜0.05）。由于PCR引物對目標(biāo)片段的甲基化序列沒有特異性，可以同步擴(kuò)增甲基化或非甲基化片段，計算出某一CpG位點在組織DNA模板中的甲基化對非甲基化的比率。此外，臨床組織DNA樣品含有腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞來源的DNA模板，即不同組織細(xì)胞DNA共存，其甲基化率反映了組織DNA樣品的不均一性。對單點甲基化水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中6個位點甲基化比率明顯高于CIN和宮頸炎，其差異顯著（P＜0.05）。這些結(jié)果提示，mRNA在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)低下的原因，也就是說基因啟動子區(qū)的高甲基化可能是影響其基因轉(zhuǎn)錄水平的原因之一。為了驗證每兩個具有顯著差異的位點之間是否有關(guān)聯(lián)性，計算各個位點的相關(guān)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)其有顯著的相關(guān)性（r＜0.5，P＜0.01），相關(guān)系數(shù)幾乎接近1，可確定兩位點關(guān)聯(lián)的程度很密切。

本研究采用半定量RT-PCR技術(shù)，從TFPI-2基因轉(zhuǎn)錄水平對宮頸病變及宮頸癌組織進(jìn)行了篩查分析，根據(jù)結(jié)果得知其差異顯著（P＜0.05），但是CINⅡ/Ⅲ和宮頸鱗癌組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見TFPI-2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下調(diào)伴隨著CIN和宮頸鱗癌發(fā)生。TFPI-2基因的異常甲基化、轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)可能是該基因表達(dá)調(diào)控在同一宮頸病變組織中的不同層次表型，可能是宮頸鱗癌發(fā)生與發(fā)展的重要標(biāo)記，可以成為宮頸鱗癌早期預(yù)警和診斷標(biāo)志物體系的組成部分。

利用MassARRAY DNA甲基化水平定量分析（質(zhì)譜測序技術(shù)），系統(tǒng)分析宮頸病變的高甲基化基因，是本課題研究的一大亮點，在國內(nèi)外尚未見研究報道，基于新疆宮頸癌高發(fā)人群—維吾爾族婦女宮頸病變疾病資源的腫瘤特異性甲基化候選基因篩查是一種特色，但TFPI-2的作用機制、治療方法以及能否真正成為宮頸癌治療的有效靶點尚有待于進(jìn)一步研究和觀察。

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