楊 惠，翟梅枝，李 麗，肖志娟

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

陜西核桃栽培品種優(yōu)系抗寒性評價

楊 惠，翟梅枝，李 麗，肖志娟

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為選育抗寒能力較強(qiáng)的栽培品種，以香玲、西林3號、魯W06-1、晉龍、清香、西洛3號、青7-2#、青-16#及青林等9個核桃栽培品種優(yōu)系一年生休眠枝條為試驗材料，分別測定了材料中組織含水量，以及經(jīng)-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃處理后材料相對電導(dǎo)率（REC）、丙二醛含量（MDA）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、游離脯氨酸和可溶性糖含量。結(jié)果表明：隨處理溫度降低，枝條相對電導(dǎo)率和丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶活性、游離脯氨酸和可溶性糖含量先增加后下降。9個品種優(yōu)系的自由水與束縛水比值范圍為0.83～1.61，半致死溫度（LT50）為-17.196℃～-24.484℃，品種優(yōu)系間差異顯著。在-20℃處理下，魯W06-1和晉龍的SOD活性快速增大至對照的2.5倍以上，游離脯氨酸濃度大于90 μg·g-1，分別為對照的2.31倍和3.05倍，抗寒性較強(qiáng)。根據(jù)隸屬函數(shù)綜合評價，9個品種優(yōu)系的抗寒性強(qiáng)弱為：魯W06-1＞晉龍＞清香＞青-16#＞西林3號＞青林＞青7-2#＞香玲＞西洛3號。

核桃；抗寒性；生理特性；隸屬函數(shù)法

核桃Juglans regia L.又名胡桃，是我國重要的經(jīng)濟(jì)林樹種，除北方嚴(yán)寒地區(qū)和少數(shù)省份外，其他26個省、市、自治區(qū)都有核桃分布。陜西作為全國核桃起源地之一，大部分地區(qū)都適宜核桃的栽培和發(fā)展，是我國核桃的主產(chǎn)省份[1]。近年，北半球冬季酷寒，全球冬季天氣變冷，這樣的寒冬可能將持續(xù)20～30年。研究表明在影響生長的8個環(huán)境因素中，極端低溫、緯度和無霜期等對其生長影響較大[2]。近30年來，陜西晚霜凍害頻繁，在渭北等嚴(yán)重的地區(qū)發(fā)生頻率達(dá)到50%以上[3]，造成核桃嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。因此，對陜西核桃栽培品種優(yōu)系進(jìn)行抗寒性鑒定及篩選高抗寒能力品種具有重要意義。

在植物抗寒研究中，組織電解質(zhì)滲出率是最常用的理化指標(biāo)，同時應(yīng)用logistic方程確定低溫半致死溫度可較準(zhǔn)確的反映抗寒能力。此方法已在佛手[4]、扁桃[5]、馬占相思[6]等植物研究中大量使用。韓玉虎等[7]分析了10個金薄香新品種與山西綿核桃的枝條電解質(zhì)滲出率，推測金薄香4號和6號抗寒性相對較強(qiáng)；王勇等[8]表明-25℃處理時的枝條電解質(zhì)滲出率可作為核桃抗寒性差異比較的參考。姜慧等[9]、楊途熙等[10]、夏清柱等[11]研究表明，組織自由水/束縛水比值、膜脂過氧化程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及抗氧化酶活性等也與植物抗寒性系密切。相昆等[12]和劉廣平等[13]分別對山東、遼寧部分核桃品系進(jìn)行抗寒性研究，但對陜西核桃栽培品系的抗寒生理研究還未見報道。本研究擬通過對低溫處理后枝條的相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖和脯氨酸含量等指標(biāo)，以及對休眠枝條組織含水量的測定，應(yīng)用隸屬函數(shù)法對陜西9個栽培品種優(yōu)系的抗寒性進(jìn)行綜合評價，以期為陜西核桃生產(chǎn)中選擇抗寒品種優(yōu)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以6個核桃良種（香玲、西林3號、晉龍、西洛3號、清香、青林）和3個優(yōu)系（魯W06-1、青7-2#、青-16#）為試驗材料，于2011年12月中旬采自管理水平和立地基本一致的核桃園。選擇均以普通北方核桃為砧木的4～5年生、長勢一致各品種或優(yōu)系5株，剪取生長部位一致、無病蟲害的當(dāng)年生核桃枝條。將采回的枝條剪成約30 cm長的小段，用自來水洗凈，然后用蒸餾水洗3次，濾紙吸干，剪口封蠟。將每個品種或優(yōu)系的枝條分成10份，每份5段，置于4℃冰柜中保存?zhèn)溆?。低溫處理時，每品種或優(yōu)系取5份枝條，分別在-10℃、-15℃、-20℃、-25℃和-30℃溫度下處理，以4℃·h-1勻速降溫，達(dá)到處理溫度后保持12 h，再控制相同速率勻速升溫，至室溫時取出，靜置4 h后用于生理生化指標(biāo)的測定，以4℃為對照。

1.2 生理生化指標(biāo)測定

相對電導(dǎo)率的測定：參考岳海等[14]的方法，將各處理后的枝條剪成0.5 cm的小段，稱取2.0 g裝入錐形瓶中，加入20 mL去離子水，抽真空30 min后于25℃保溫12 h，振蕩混勻，用德國EC200便攜式電導(dǎo)儀測電導(dǎo)值S1。再將其煮沸30 min，冷卻測電導(dǎo)值S2。相對電導(dǎo)率=（S1－C）/（S2－C）×100%，其中：C為本底電導(dǎo)率值。重復(fù)3次。通過SPSS13.0軟件擬合Logistic方程，并根據(jù)朱根海等[15]的方法計算半致死溫度（LT50）。

枝條含水量、自由水/束縛比值的測定參照張志良等[16]的方法。

丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光還原法；游離脯氨酸含量的測定用茚三酮比色法；可溶性糖含量的測定使用蒽酮試劑，4項指標(biāo)測定參考高俊鳳[17]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理及綜合評價方法

試驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和聚類分析，采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價，計算方法和公式參照司劍華等[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃枝條的組織含水量和自由水/束縛水比值

植物組織中的水分以自由水和束縛水兩種狀態(tài)存在，其含水量以及自由水/束縛水含量比值常與生命活動及抗性密切相關(guān)。休眠期枝條含水量較低，代謝緩慢以適應(yīng)低溫環(huán)境。且自由水與束縛水的比值越小，一方面低溫下細(xì)胞內(nèi)可形成冰晶的自由水含量越小，另一方面束縛水參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，能穩(wěn)定原生質(zhì)，比例越大，抗寒性越強(qiáng)，因此常用自由/束縛水比值來評價植物抗寒性[19]。

由表1可知，9個品種或優(yōu)系的枝條含水量、自由水和束縛水含量差異不顯著，但自由水/束縛水比值差異顯著（P＜0.05）。晉龍、青7-2#、清香3個品系的自由水/束縛水比值小于1，晉龍的比值最小為0.83，說明低溫寒害時，其細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰和細(xì)胞脫水的程度可能小于其他品種或優(yōu)系，抗寒性較強(qiáng)。其他6個品種或優(yōu)系的自由水/束縛水比值均大于1，其中西洛3號的比值最大，為1.61。在冬季休眠時期，西洛3號細(xì)胞內(nèi)自由水含量多，比例大，推測其枝條的抗寒性較差。

2.2 低溫脅迫對核桃枝條相對電導(dǎo)率、膜脂過氧化以及SOD酶活性的影響

低溫脅迫對植物細(xì)胞的主要影響是造成質(zhì)膜透性改變甚至破壞，引起內(nèi)含物外泄[20]。圖1顯示，在處理溫度范圍內(nèi)，隨溫度的降低，核桃枝條相對電導(dǎo)率增大，整體呈現(xiàn)“S”型曲線變化趨勢。其中，西洛3號在低溫處理時，相對電導(dǎo)率較其他品系大，而清香相對電導(dǎo)率均較小，說明低溫處理對不同品種優(yōu)系細(xì)胞膜的破壞程度不同。相同溫度處理下，相對電導(dǎo)率越小說明質(zhì)膜受到的影響越小，抗寒性越強(qiáng)，所以初步判斷清香的抗寒能力強(qiáng)于西洛3號。

表1 不同核桃品種優(yōu)系組織含水量、自由水和束縛水含量及其比值Table 1 Water content and ratio of free water to bound water among different walnut cultivars and superior lines

圖1 低溫處理下核桃枝條相對電導(dǎo)率變化Fig. 1 Changes of relative electric conductivity in twigs of 9 cultivars and superior lines in low temperature

何小勇等[21]研究表明，將植物組織相對電導(dǎo)率擬合logistic方程，得到的拐點溫度越低，表示半致死溫度越低，植物抗寒能力越強(qiáng)。由表2可以看出，9個品種優(yōu)系擬合度極顯著，并且6個品種優(yōu)系的R2大于0.99，說明它們配合logistic方程曲線的效果很好。根據(jù)擬合方程，魯W06-1、青林、晉龍的半致死溫度均低于-20℃，其中魯W06-1最低，為-24.483℃。其他6個品種優(yōu)系的半致死溫度較高，尤其青7-2#和西洛3號的半致死溫度均高于-18℃。經(jīng)聚類分析，將9個核桃品種優(yōu)系的抗寒性初步分成強(qiáng)、中等和弱三類：魯W06-1和青林抗寒性較強(qiáng)，晉龍、清香、青-16#、西林3號及香玲的抗寒性中等，青7-2#和西洛3號的抗寒性較弱。

表2 核桃枝條相對電導(dǎo)率的logistic方程和LT50及聚類分析Table 2 Logistic equation according to relative electric conductivity and LT50 with cluster analysis

除相對電導(dǎo)率外，測定膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量及SOD活性也能夠較好地反映細(xì)胞對低溫脅迫的應(yīng)答[9,14,22]。本研究結(jié)果顯示，隨處理溫度的降低，核桃枝條丙二醛（MDA）含量總體上升，除西洛3號和魯W06-1，其他品種優(yōu)系均表現(xiàn)出“先上升后下降再上升”的趨勢（圖2）。在-15℃處理下，青-16#和青林的MDA含量較高，但-20℃時其含量分別迅速降低到-15℃的47.71%和51.01%。與大部分品種優(yōu)系不同，西洛3號在-20℃處理時的MDA含量比-15℃增加51.72%，且其SOD酶活性較低，推測其抗寒能力較差。圖2還顯示，大部分品種優(yōu)系核桃枝條中SOD酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在-20℃時出現(xiàn)最大值。清香、晉龍、魯W06-1和其他品種優(yōu)系相比，SOD酶活性較高，且分別為對照的4.45倍、2.86倍和2.52倍，表明這3個品種優(yōu)系受到低溫脅迫時抗氧化能力較強(qiáng)，推測它們的抗寒性較強(qiáng)。

綜合分析認(rèn)為，當(dāng)處理溫度為-20℃時，低溫脅迫使細(xì)胞達(dá)到一個臨界狀態(tài)，大部分品種優(yōu)系表現(xiàn)為SOD酶活性顯著增大，抗氧化能力增加，有助于清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，減少膜脂過氧化，降低MDA含量，維護(hù)質(zhì)膜穩(wěn)定。當(dāng)溫度繼續(xù)下降時（如-25℃），細(xì)胞受到的脅迫超出自身耐受范圍，SOD活性迅速下降，活性氧濃度增加，膜脂過氧化程度加劇，MDA含量上升，細(xì)胞膜透性遭受不可逆?zhèn)Α?/p>

圖2 低溫處理下MDA含量和SOD酶活性的變化Fig. 2 Changes of MDA content and SOD activities in twigs of 9 cultivars in low temperature

2.3 低溫脅迫對核桃枝條中游離脯氨酸和可溶性糖含量的影響

游離脯氨酸和可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與細(xì)胞水分的調(diào)節(jié)，減少細(xì)胞脫水，誘導(dǎo)植物的抗逆性[23]。在低溫脅迫下，它們能夠主動積累，提高植物的抗寒能力。

核桃枝條中游離脯氨酸含量隨溫度降低先上升后下降，不同品種優(yōu)系變化趨勢較一致。晉龍、魯W06-1、西洛3號和清香4個品種優(yōu)系的游離脯氨酸含量在-20℃出現(xiàn)最大值，而其他品種優(yōu)系在-15℃處理后就逐漸降低。處理前，晉龍和魯W06-1的游離脯氨酸含量較高，為其他品種優(yōu)系的一倍左右；-20℃處理時，游離脯氨酸含量增大至90 μg·g-1FW以上，分別為其對照的3.05倍和2.31倍。當(dāng)溫度繼續(xù)降低，游離脯氨酸含量迅速降低，分別至-20℃時的29.22%和26.42%。可溶性糖含量和游離脯氨酸含量變化趨勢基本一致，各品種優(yōu)系總體呈先上升后下降的變化，但不同品種優(yōu)系達(dá)到最大值的處理溫度不同，含量增加的幅度也不一樣。清香的可溶性糖含量在-10℃出現(xiàn)最大值，為對照的1.97倍，而青7-2#在-15℃出現(xiàn)最大值，且僅為對照的1.3倍。

在低溫脅迫環(huán)境，不同品種優(yōu)系間細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物含量差異顯著，且不同品種優(yōu)系細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加程度和隨溫度積累的速率也不同。由圖3顯示，-10℃處理時，6個品種優(yōu)系的可溶性糖含量迅速增加達(dá)到最大值，游離脯氨酸含量變化較小；當(dāng)處理溫度繼續(xù)降低，游離脯氨酸含量隨溫度降低而增加，但可溶性糖含量隨溫度下降而減小。由此推測，低溫脅迫時，對低溫較敏感的可溶性糖含量迅速增加，參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)；當(dāng)處理溫度繼續(xù)降低時，可溶性糖含量不再增加，游離脯氨酸含量快速增加，并代替可溶性糖成為主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；當(dāng)處理溫度達(dá)到-25℃，二者的含量與對照接近，細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力迅速下降。

2.4 應(yīng)用隸屬函數(shù)評價抗寒性

圖 3 低溫處理下游離脯氨酸和可溶性糖含量的變化Fig. 3 Changes of free proline and soluble sugar content in twigs of 9 cultivars in low temperature

植物抗寒性是在低溫環(huán)境中多因素綜合表達(dá)、多個生理生化反應(yīng)共同作用的結(jié)果， 所以綜合與抗寒性相關(guān)的多指標(biāo)進(jìn)行評價，比單個指標(biāo)評判抗寒性更具有科學(xué)性和可靠性[24]。對本研究6個指標(biāo)采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，計算各品種優(yōu)系不同溫度處理下各指標(biāo)的隸屬度，累加所有指標(biāo)求平均隸屬度來綜合評價其抗寒性，平均隸屬度越大表明抗寒性越強(qiáng)。

由表3可看出，魯W06-1和晉龍綜合隸屬度大于0.6，抗寒能力強(qiáng)，西洛3號小于0.3，抗寒能力弱，其他6個品種優(yōu)系均為中等抗寒品系。這與相昆等[12]評價其他核桃品系抗寒性的分級標(biāo)準(zhǔn)相同。按照綜合評價結(jié)果，9個品種優(yōu)系的抗寒性強(qiáng)弱為：魯W06-1＞晉龍＞清香＞青-16#＞西林3號＞青林＞青7-2#＞香玲＞西洛3號。這與-20℃處理時9個品種優(yōu)系MDA含量的分析結(jié)果完全相同，還與自由水/束縛水、相對電導(dǎo)率、SOD酶活性等其他指標(biāo)分析結(jié)果基本一致。說明隸屬函數(shù)法適用于核桃休眠枝條的抗寒性鑒定。

表3 不同核桃品種優(yōu)系抗寒性綜合評價Table 3 Integrated assessment of cold resistance of different walnut cultivars and superior lines

3 討 論

質(zhì)膜是細(xì)胞受到凍害的原初部位，其破壞程度直接反映細(xì)胞受到的傷害程度，所以常用電導(dǎo)法測定抗寒性。對核桃抗寒性的鑒定，常用低溫處理后材料的電導(dǎo)率與煮沸后材料的電導(dǎo)率的比值表示相對電導(dǎo)率，有研究將相對電導(dǎo)率值接近50%的處理溫度作為LT50分析[7-8,12-13]，也有研究擬合logistic方程求LT50，但擬合度較低[24-26]。朱根海等[15]認(rèn)為，即使未受低溫處理，組織在去離子水中浸提一段時間也會有電解質(zhì)滲出，且不同材料存在差異，所以有必要消除本底的影響。本研究測定相對電導(dǎo)率時去除了本底電解質(zhì)滲出率，9個品種優(yōu)系對logistic方程的擬合度均極顯著，且5個品系的R2達(dá)到0.99以上，求出的LT50在-20℃左右。該結(jié)果與相關(guān)記載[2]：“幼齡樹在-20℃條件下出現(xiàn)‘抽條’或凍死”的結(jié)論一致。去除本底影響后，相對電導(dǎo)率對logistic方程的擬合度提高，且在拐點溫度處理時，SOD活性和游離脯氨酸含量快速增大，MAD大幅下降，處于生理生化應(yīng)答臨界狀態(tài)。由此說明，測定組織相對電導(dǎo)率時去除本底影響，再擬合logistic方程求出LT50，可以較好地評價核桃不同品種或優(yōu)系的抗寒性。

可溶性糖和游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以通過增加細(xì)胞的保水力來提高植物的抗寒性。游離脯氨酸親水性強(qiáng)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)水合作用，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運輸和調(diào)節(jié)滲透壓等，且一些研究表明，植物抗性強(qiáng)弱與逆境下游離脯氨酸積累量呈正相關(guān)，因此可以鑒定抗逆性[27]。但楊途熙等[10]研究認(rèn)為，游離脯氨酸含量與抗寒性強(qiáng)弱并不是密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)大部分品種優(yōu)系的游離脯氨酸含量隨溫度的變化先增大后減小，抗寒能力較強(qiáng)的品種優(yōu)系（如晉龍和魯W06-1）最大值不僅遠(yuǎn)高于其他品種優(yōu)系，而且為對照的3.05倍和2.31倍，而抗寒能力中等的品種優(yōu)系（如香玲）最大值僅為對照的1.78倍。所以，游離脯氨酸含量可以作為核桃抗寒性的評價指標(biāo)。作為另一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物組織中可溶性糖含量與耐寒能力的獲得密切相關(guān)[28]。可溶性糖隨溫度降低的變化趨勢與游離脯氨酸相似，前者峰值出現(xiàn)的溫度較后者峰值出現(xiàn)的溫度高，說明植物細(xì)胞內(nèi)可溶性糖對低溫脅迫較敏感，一旦受到低溫脅迫就迅速增加。前人[9,12,14]研究低溫對植物的影響時，多將游離脯氨酸含量與可溶性蛋白含量結(jié)合起來分析調(diào)節(jié)物質(zhì)的應(yīng)答。本研究結(jié)果表明，核桃枝條組織受到低溫脅迫后先積累可溶性糖，脅迫加大后積累游離脯氨酸，二者共同調(diào)節(jié)滲透壓，提高枝條的抗寒能力。說明低溫脅迫下游離脯氨酸和可溶性糖也能較好地反映細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)變化情況。但這種調(diào)節(jié)方式在其他核桃品種或優(yōu)系或組織中是否存在同樣的情況還有待深入研究。

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Evaluation of cold resistance of walnut cultivars and superior lines in Shaanxi Province

YANG Hui, ZHAI Mei-zhi, LI Li, XIAO Zhi-juan

(College of Forestry, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling712100, Shaanxi, China )

In order to select high cold-tolerance walnut cultivars in Shaanxi Province, nine walnut cultivars and superior lines were studied, including Xiangling, Xilin NO.3, Lu W06-1, Jinlong, Qingxiang, Xiluo NO.3, Qing7-2#, Qing -16#and Qinglin. Annual branches of nine walnut cultivars and superior lines were treated respectively at -10℃ , -15℃, -20℃, -25℃ and -30℃ . The results show that the relative electric conductivity(REC) and malondialdehyde content(MDA) increased when the temperature became lower,while superoxide dismutase(SOD) activity, free proline and soluble sugar contents firstly increased then decreased; Among cultivars and superior lines there were significant differences in the ratio of free water content to bound water content and semi-lethal temperature (LT50),the ratio of free water content to bound water content was intervenient 0.83 and 1.61, and the range of LT50was -17.20 to -24.48℃;Under -20℃, SOD activity of Lu W06-1 and Jinlong increased rapidly to its maximum value that was over 2.5 times of the control group, and their free proline content was more than 90 μg·g-1, which was 2.31 times and 3.05 times of the control group respectively.According to a comprehensive evaluation based on subordinate function value analysis, their cold resistance from high to low was: Lu W06-1, Jinlong, Qingxiang, Qing-16#, Xilin NO.3, Qinglin, Qing 7-2#, Xiangling and Xiluo NO.3.

Juglans regia L. ; cold resistance; physiological property; subordinate function

S759.3

A

1673-923X(2013)04-0050-06

2012-12-11

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004027）

楊 惠（1988-），女，湖南常德人，碩士研究生，研究方向為植物抗寒生理生態(tài)

翟梅枝（1963-），女，河南西平人，博士，教授，主要從事植物病害生物防治、植物資源開發(fā)利用等教學(xué)與研究；E-mail：plum-zhai@163.com

[本文編校：吳 彬]