不同區(qū)域小油桐種質(zhì)差異與ISSR分子標(biāo)記研究

朱炳耀，楊志敏，莊志鴻，陳 彬，陳 堅(jiān)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州350003）

不同區(qū)域小油桐種質(zhì)差異與ISSR分子標(biāo)記研究

朱炳耀，楊志敏，莊志鴻，陳 彬，陳 堅(jiān)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州350003）

從臺(tái)灣、貴州、云南、江西、江蘇、湖北、重慶和福建省引進(jìn)小油桐樣品7份，苗木4份，對(duì)種子進(jìn)行形態(tài)觀察、縱橫徑測(cè)量、百粒重和含油率測(cè)試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各地收集的種子形態(tài)相近，但在種子大小，百粒重，含油率方面各不相同，以云南勐納種子最大，含油率最高，達(dá)59.2%。經(jīng)ISSR分子標(biāo)記的聚類分析發(fā)現(xiàn)：11個(gè)小油桐品種的遺傳距離和地理位置沒有必然聯(lián)系; 用5條ISSR引物可以鑒別出至少6種小油桐的種質(zhì)資源,但分別從江西九江、貴州望謨和湖北咸豐引進(jìn)的3個(gè)商品種（種子）卻難以辨別,而分別從福建漳州和云南購(gòu)買的商品種苗木之間也難以區(qū)別。這說(shuō)明我國(guó)不同地域種植的商品種可能出自相近的種源。

小油桐種子；種子形態(tài)；種子性狀；分子標(biāo)記

小油桐Jatropha curcas L，又名麻瘋樹、 小桐子、亮桐、 臭油桐、 綠玉樹、 芙蓉樹、青桐木、膏桐、 黃腫樹、 水漆等， 原產(chǎn)地美洲，在我國(guó)云南、四川、廣西、貴州、海南、等地有集中種植，在廣東、福建、臺(tái)灣有零星分布[1]。據(jù)研究者測(cè)定小油桐種子含油率極高，高達(dá)40%～ 60%，且富含蛋白質(zhì)( 約占干重19%～ 27%)[2]；當(dāng)年種子發(fā)芽率高，成苗率高，生長(zhǎng)速度快[3]，小油桐與油桐同為大戟科落葉灌木或小喬木，屬邊際經(jīng)濟(jì)林樹種，不與糧食作物爭(zhēng)地，在原油日益匱乏、環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重的今天備受關(guān)注，是理想的生產(chǎn)生物柴油的能源植物[4]。其植株喜光、耐干旱貧膺，聯(lián)合國(guó)已經(jīng)將其作為水土保持植物，列入扶貧的重大項(xiàng)目，廣泛用于生態(tài)建設(shè)加以扶持并獲得成功[5]。目前世界上已有20多個(gè)國(guó)家種植小油桐，用于生產(chǎn)生物柴油[6]，是我國(guó)緩解能源危機(jī)最有潛在的生物質(zhì)樹種[7]。

我國(guó)幅員遼闊，各地生產(chǎn)的小油桐種質(zhì)資源豐富。由于不同品種的小油桐種子大小，含油率等經(jīng)濟(jì)性狀各不相同，直接影響小油桐的種植經(jīng)濟(jì)效益。為了篩選及推廣優(yōu)質(zhì)的小油桐種質(zhì)資源，本研究對(duì)從全國(guó)各地征集了11份小油桐品種資源，其中分別從臺(tái)灣、貴州、云南、江西、江蘇、湖北和福建省引進(jìn)的7份為小油桐種子，另外，分別從福建漳州、湖北咸豐、重慶和貴州望漠引進(jìn)了4份小油桐的苗木；通過(guò)比較不同地域小油桐種子形態(tài)特征，縱橫徑測(cè)量，百粒重觀察和含油率測(cè)試；以及對(duì)小油桐種質(zhì)資源進(jìn)行分子標(biāo)記技術(shù)等研究。從而更好地開發(fā)利用小油桐種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小油桐種質(zhì)資源收集

本課題共收集來(lái)自臺(tái)灣?。═）、云南勐納(N)、貴州省農(nóng)科院(G1)、貴州省望謨縣(GW)、江蘇省沭陽(yáng)（Y印度種）、江西省九江(J)、湖北省咸豐(H)等地的7個(gè)小油桐種子，和來(lái)自貴州望漠（1）福建漳州（2）、重慶（3）、云南（4）的4個(gè)小油桐種苗，分別進(jìn)行登記造冊(cè)。

表1 征集的小油桐基因資源Table 1 Collected genetic resources of Jatropha curcas L

1.2 方 法

1.2.1 小油桐種質(zhì)的觀測(cè)

對(duì)不同地方收集的小油桐種子用扭力天平稱取百粒重、然后拔去種皮，稱取種仁重除以種子重量得出出仁率，含油率測(cè)定參照《糧食、油料檢驗(yàn)-粗脂肪測(cè)定方法（GB5582-85）》之索氏提取小油桐種子脂肪并測(cè)定含油率。

1.2.2 小油桐種質(zhì)資源的ISSR分子標(biāo)記

1.2.2.1 引物及其序列的擴(kuò)增

用于小油桐ISSR分子標(biāo)記的引物序列及擴(kuò)增條帶如表2所示。

表2 引物，引物序列和擴(kuò)增帶數(shù)Table 2 ISSR primers, sequences and numbers of band amplified

1.2.2.2 DNA 提取與 ISSR 的 PCR 擴(kuò)增

按照文獻(xiàn)[8] 報(bào)道的方法提取小油桐基因組總DNA，對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，得到8條條帶清晰，重復(fù)性好的引物(見表2)。用于本研究。 ISSR擴(kuò)增體系按文獻(xiàn)[9] 方法優(yōu)化，總體積 25 μL：模板 DNA10 ～ 30 ng、1 UTaq 酶、4 種dNTP 為 2 μL（濃度 215 μmol/L）、10×PCR 的緩沖液 2.15 μL、MgCl21.15 μL、 ISSR引物為2 μL（10 μmol/L）、PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，38個(gè)循環(huán)反應(yīng)為：94 ℃變性30 s，48 ℃～55℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，最后在72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀上觀察照相。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

將電泳圖上的每1條帶定為一個(gè)Marker標(biāo)記，代表了一個(gè)結(jié)合反應(yīng)的位點(diǎn)。按膠上的同一個(gè)水平位置擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)與否進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，出現(xiàn)帶（包括弱帶）的標(biāo)“1”，不出現(xiàn)的記為“0”，構(gòu)建二元矩陣，計(jì)算Nei氏遺傳距離，用非加權(quán)的成對(duì)算術(shù)平均（UPGMA）建立起聚類系統(tǒng)的樹狀分支圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小油桐種子形態(tài)觀測(cè)

從不同地區(qū)收集的小油桐種子形態(tài)上區(qū)別不大，但種子大小有一些差異（見圖1）。外觀上看云南勐臘引進(jìn)的小油桐種子個(gè)體最大，貴州農(nóng)科院的最小，其余居中。我們分別對(duì)不同地域征集的小油桐種子進(jìn)行縱橫徑測(cè)量，小油桐種子縱徑為1.55～1.91 cm，縱徑最長(zhǎng)的為云南勐臘品種1.91 cm，最小的為貴州農(nóng)科院收集的1.55 cm；小油桐種子橫徑為1.01～1.18 cm，橫徑最大為云南勐臘的1.18 cm，最小的為貴州農(nóng)科院收集的1.01 cm。

2.2 小油桐種子的百粒重和出仁率測(cè)定

我們對(duì)不同地域收集的7份小油桐種子進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀測(cè)定，結(jié)果見表3。從表3中可以看出，小油桐種子百粒重大都在50～60 g之間，云南勐臘百粒重為最高達(dá)到80.6 g；出仁率大部分在63～66.5%之間，但征集自臺(tái)灣的小油桐種子的出仁率最低，為54.2%，這與臺(tái)灣種由于收集保存日期比較長(zhǎng)，加上不是低溫保存消耗比較大有關(guān)；種仁的干基含油率都在50%以上，以云南勐臘最高達(dá)到59.2%。

圖1 國(guó)內(nèi)不同地域征集的小油桐種質(zhì)資源的種子大小比較Fig.1 Comparison of seed size among J. curcas collected from different areas in China

表3 不同收集地小桐子的種子經(jīng)濟(jì)性狀 (2010年4月8日)Table 3 Seeds economic characters of J. curcas collected from different areas in China

2.3 小油桐ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增

近年來(lái)，ISSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于桉樹[10]、細(xì)葉桉[11]、胡桃楸[12]、地方茶樹[13]等林木品種資源的遺傳多樣性分析，并取得良好的效果。我們用8條ISSR引物對(duì)11份征集的小油桐DNA樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增, 其中有7份DNA提取自種子中的子葉及胚的樣本，而4份提取自葉片樣本。在所用的引物中有3條不能擴(kuò)增出較明顯的多態(tài)性條帶,其中有5條引物可產(chǎn)生具有多態(tài)性的條帶。如圖2所示分別為809號(hào)和864號(hào)引物對(duì)11份植株樣本的擴(kuò)增結(jié)果。 前者沒有明顯的多態(tài)性條帶，而后者多態(tài)性卻較高；可以很明顯的鑒別出征集至臺(tái)灣、貴州、重慶的小油桐樣品。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)來(lái)自貴州省的3份樣品的帶型有著明顯的不同。

2.4 征集的小油桐樣品的聚類分析

對(duì)11份從國(guó)內(nèi)各地域征集的樣本的ISSRPCR結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果總結(jié)在圖3中。根據(jù)聚類結(jié)果可以看出：本文中的11個(gè)小油桐品種的遺傳距離和征集來(lái)源的地理位置沒有必然聯(lián)系。用5條ISSR引物可以鑒別出至少6種不同的小油桐種質(zhì)資源。但分別從江西九江、貴州望謨和湖北咸豐引進(jìn)的3個(gè)商品種（種子）卻難以辨別，而分別從福建漳州和云南購(gòu)買的商品種苗之間也難以區(qū)別。說(shuō)明我國(guó)不同地域種植的商品種可能出自相近的種源。

圖2 2條ISSR引物對(duì)從全國(guó)各地征集的11份小油桐擴(kuò)增結(jié)果的比較Fig.2 Amplification results of 11 samples of J. curcas collected from different areas in China with 2 ISSR primers

3 討 論

小油桐原產(chǎn)于南美的墨西哥，引入中國(guó)境內(nèi)后半野生或人工栽種于熱帶與亞熱帶區(qū)域，面積覆蓋較廣，形成了豐富的資源。從我們目前收集到的7個(gè)小油桐種子外觀比較來(lái)看：形態(tài)差別不大，個(gè)體差異較大。其中云南勐納收集的小油桐種子在百粒重，出仁率和含油率方面性狀最佳，可以在適宜地區(qū)試驗(yàn)推廣。從ISSR分子標(biāo)記圖譜看，我國(guó)湖北、江西等地引進(jìn)的小油桐商品種之間差異不大。近年來(lái)，我國(guó)大批引進(jìn)海外品種，如江蘇引進(jìn)印度的品種，與國(guó)內(nèi)品種交叉種植，如不加以分子水平鑒別，很難區(qū)分開來(lái)。文獻(xiàn)[14] 對(duì)生長(zhǎng)在云南不同地域的小油桐的居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：小油桐居群間的遺傳距離和它們所在的地理位置距離間的大小沒有相關(guān)性，從而推測(cè)云南小油桐可能引自不同的地區(qū)。我們通過(guò)研究進(jìn)一步推測(cè)：小油桐最初可能由國(guó)外不同的產(chǎn)地引入我國(guó)各省市地區(qū)進(jìn)行種植, 這樣即會(huì)導(dǎo)致地理位置相差很大的兩個(gè)地區(qū)的居群親緣關(guān)系反而很近，如江蘇或其他省均引進(jìn)印度種；同時(shí)，也會(huì)造成同一省域不同地區(qū)的居群親緣關(guān)系反而很遠(yuǎn)，如我們從貴州省不同單位引種的小油桐之間差異反而大于從不同省份引種的小油桐之間的差異也就有了比較合理的解釋。

圖3 5條ISSR引物對(duì)全國(guó)各地征集的11份小油桐DNA擴(kuò)增結(jié)果的聚類分析Fig. 3 Cluster of amplification of 11 samples of J. curcas collected from different areas in China with 5 ISSR primers

根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道,小油桐是極具潛在的能源和經(jīng)濟(jì)作物。利用它可以開發(fā)產(chǎn)生生物柴油[15]、中藥研制、病蟲害生物防治、水土保持、高級(jí)環(huán)保型油漆、涂料和防腐劑等有多領(lǐng)域應(yīng)用前景[6-7]。本研究通過(guò)對(duì)全國(guó)各地征集的小油桐11個(gè)種質(zhì)資源ISSR標(biāo)記的分析，將11個(gè)種質(zhì)資源進(jìn)行了初步的區(qū)分。這為今后的從事小油桐品種選育工作打下了一定的基礎(chǔ)，可以從中選擇較遠(yuǎn)親緣關(guān)系的小油桐品種作為參試的種，通過(guò)示范種植比較或用于育種親本以增大其后代的遺傳變異性，以達(dá)到最大限度地改良小油桐品種性狀的目的。此外，還希望進(jìn)行更多的分析測(cè)試，針對(duì)不同區(qū)域和產(chǎn)地小油桐品種表現(xiàn)出不同的生育生長(zhǎng)特征與種子的理化特性,對(duì)各區(qū)域和產(chǎn)地的小油桐品種種質(zhì)資源進(jìn)行劃分，把它分為高油、高產(chǎn)、高效、高毒等不同特性的小油桐品種,用于生產(chǎn)生物柴油、病蟲害生物防治、水土保持、環(huán)保型化工用油漆等不同用途的優(yōu)良品種。

參與文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志（第四十四卷，第二分冊(cè)）[M]. 北京: 科學(xué)出版社，1996:147-148.

[2] Openshaw K. A review of Jatropha curcas: an oil Plant of unidentifiied promise[J]. Biomass and Bioenergy, 2000，19(1):1-15.

[3] 朱炳耀,林叢發(fā),楊志敏,等.小油桐育苗技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(21)：12931-12932

[4] 張玲玲，彭俊華.油桐資源價(jià)值及其開發(fā)利用前景[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2011，29(2)：130-135

[5] 何文淑,肖榮貴,楊曉瓊,等.麻瘋樹在貧困地區(qū)農(nóng)村發(fā)展和生態(tài)建設(shè)中的開發(fā)前景[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(10):33-36.

[6] 王兆玉,林敬明,徐 增,等.小油桐生物活性成分與藥用價(jià)值研究進(jìn)展[J].中藥材，2007，30(10):1332-1335.

[7] 譚曉風(fēng)，將桂雄，譚方友,等.我國(guó)油桐產(chǎn)業(yè)化發(fā)展戰(zhàn)略研究調(diào)查報(bào)告[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2011，29（3）：1-7.

[8] 歐文軍, 李開綿, 王文泉,等.小桐子基因組DNA 的提取及ISSR- PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008，24(5)：409-413.

[9] 王桂娟, 陳茂盛, 向振勇,等.小桐子ISSR-PCR 體系的優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008,3: 162-165.

[10] 張黨權(quán), 田 華, 謝耀堅(jiān), 等.桉樹4個(gè)種遺傳多樣性的ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(1)：12-17.

[11] 張黨權(quán)，田 華 ，謝耀堅(jiān)，等，細(xì)葉桉遺傳多樣性的I S S R分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(5)：91-94.

[12] 王東娜, 牟長(zhǎng)城,高 卓,等.胡桃楸天然種群遺傳多樣性的ISSR分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2011,29(2):22-29.

[13] 吳 田,沈曉進(jìn),李法營(yíng),等.雙江古茶樹與云南大葉種茶群體品種間的ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(3): 136-140.

[14] 向振勇,宋松泉,王桂娟,等.云南南部不同種源地小桐子遺傳多樣性的ISSR 分析[J].云南植物研究,2007,29(6):619- 624.

[15] 文 彬.小油桐籽油生產(chǎn)生物柴油的經(jīng)濟(jì)性探討[J].煉油技術(shù)與工程, 2007,18(7):47-49.

Study on character differences of Jatropha curcas L seeds from different region in China and analysis with ISSR molecular marker

ZHU Bing-yao, YANG Zhi-min, ZHUANG Zhi-hong, CHEN Bin, CHEN Jian

(Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian, China)

Seven samples of seeds and 4 samples of seedlings of Jatropha curcas L were collected from different provinces of China including Taiwan, Guizhou, Yunnan, Jiangxi, Jiangsu, Hubei and Fujian. The appearances of seeds were observed and the diameter of seed, mass of 100 seeds, oil content in the seeds were measured; the seeds from Yunnan Mengman were the biggest in size, theirs oil yield reached the hightest,being 59.2%. The results of cluster analysis by ISSR molecular marker indicate that there was not necessarily linkage between genetic distance and geographical position of the 11 J. curcas seeds and seedlings; At least 6 samples of J. curcas could be differentiated with 5 primers of ISSR,however, the 3 samples of commercial seeds collected from Jiujiang Jiangxi, Wanmo Guizhou and Xiangfen Hubei could not been identified;Besides the two commercial seedlings purchased from Zhangzhou of Fujian, Yunnan could also not been identified. It is shown that the commercial cultivars of J. curcas in different regions of China probably originated from the similar provenance.

Jatropha curcas L; seed morphology; seed character; molecular marker

S794

A

1673-923X(2013)04-0013-04

2012-10-16

福建省科技廳重點(diǎn)課題(項(xiàng)目編號(hào)：200901010014)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技下鄉(xiāng)“雙百”行動(dòng)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：sbmb1250)

朱炳耀(1962-)，男，福建閩侯人，副研究員，主要從事植物基因資源收集與利用開發(fā)研究；E-mail:zhubinyao@sohu.com

陳 堅(jiān)(1965-)，男，福建永泰人，研究員，從事植物基因資源評(píng)價(jià)及利用研究；E-mail：cjform2005@yahoo.com.cn

[本文編校：歐陽(yáng)欽]