EZH2和CBX7在皮膚血管瘤中的異常表達(dá)及意義

唐 甜 陳小希 張端蓮

（1武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 湖北430060；2湖北省地質(zhì)職工醫(yī)院 武漢430072；3武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎教研室 湖北430071）

血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性血管腫瘤，它是一種由血管形成異常而引起的疾病，其特點(diǎn)是通過(guò)未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞彌散增殖而在出生后快速生長(zhǎng)，之后自發(fā)消退。血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖是血管瘤的主要組織學(xué)特點(diǎn)［1－3］。雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退，但是一些血管瘤病變嚴(yán)重?fù)p壞正常組織，產(chǎn)生并發(fā)癥。目前的治療方法的成效很有限，一些治療方法的副作用也限制了其應(yīng)用。深入研究和了解血管瘤的發(fā)病機(jī)理將為治療血管瘤提供更好的治療手段。

EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅zeste基因增強(qiáng)子（E（z））的人類同源物，是PcG（Poly comb Group）基因家族的重要成員之一。在PcG基因家族中，EZH2起著核心作用。目前已在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EZH2表達(dá)增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并發(fā)現(xiàn)EZH2高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后差相關(guān)［4，5］。CBX7（ehromobox homolog 7）與黑腹果蠅的異染色質(zhì)蛋白（Heteroehromatin Protein，HPI）具有同源性，主要分布于染色質(zhì)、核，其分子功能通過(guò)與染色質(zhì)結(jié)合實(shí)現(xiàn)。目前已有研究表明CBX7在腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)［6］。

本文通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中EZH2和CBX7的表達(dá)水平，以探討其在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為臨床上治療血管瘤提供更多參考和指導(dǎo)。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來(lái)源

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2005年9月－2009年12月皮膚毛細(xì)血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性25例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤26例，退化期血管瘤24例。另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對(duì)照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人EZH2和CBX7單克隆抗體（購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（購(gòu)于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2.方法

2.1 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色

2.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)EZH2和CBX7相關(guān)抗原

2.2.1 具體步驟：

（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%過(guò)氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過(guò)氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，購(gòu)買的陽(yáng)性片作為EZH2和CBX7的陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

（1）EZH2和CBX7都是以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)EZH2和CBX7的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽(yáng)性面積率＝單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.EZH2的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)強(qiáng)（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（圖2）；正常皮膚組血管內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（圖3）。圖像分析結(jié)果見(jiàn)表1。增生期組EZH2的表達(dá)明顯高于退化期組和正常皮膚組 （P＜0.05），而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 血管瘤不同時(shí)期EZH2表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

表1 血管瘤不同時(shí)期EZH2表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽(yáng)性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 26 0.3201±0.0056＊ 0.3650±0.0058＊退化期組Involuting Group 24 0.0584±0.0026△ 0.0815±0.0029△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.0520±0.0024▲ 0.0793±0.0027▲

2.CBX7的表達(dá)

增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒，CBX7表達(dá)強(qiáng)（圖4）；退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（圖5），正常皮膚組血管內(nèi)皮細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（圖6）。圖像分析結(jié)果見(jiàn)表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)顯著高于退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和正常皮膚組（P＜0.05），而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同時(shí)期CBX7表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

表2 血管瘤不同時(shí)期CBX7表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽(yáng)性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 26 0.3014±0.0049＊ 0.3593±0.0052＊退化期組Involuting Group 24 0.0675±0.0027△ 0.0751±0.0030△正常皮膚組Normal Skin Group 5 0.0601±0.0025▲ 0.0721±0.0029▲

討 論

皮膚血管瘤是常見(jiàn)的血管腫瘤之一，以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖為主要組織學(xué)特點(diǎn)。大多數(shù)血管瘤的生長(zhǎng)經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期，即增生期、退化期及退化完成期。增生期是在血管瘤發(fā)病初期幾個(gè)月內(nèi)，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，以大量毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞快速增殖和血管異常形成為典型特征；隨后，增殖期血管瘤進(jìn)入漫長(zhǎng)的退化期，該期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)纖維和脂肪組織增生，替代血管瘤增生組織；退化期持續(xù)約數(shù)月到數(shù)年，而后進(jìn)入退化完成期［7－8］。

一般認(rèn)為，血管瘤是血管生長(zhǎng)及修復(fù)的紊亂，其主要的特征是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞增生。這也與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，即細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等相一致［9］。

EZH2基因是1996年發(fā)現(xiàn)的一種新的人類基因，EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蠅基因增強(qiáng)子（E（z））的人類同源物，是PcG家族的重要成員之一。作為一種重要的PcG蛋白，EZH2參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成、基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及生長(zhǎng)控制。大量研究證據(jù)支持EZH2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［10－12］。目前已在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EZH2表達(dá)增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并發(fā)現(xiàn)EZH2高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后差相關(guān)。體外研究亦支持EZH2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［13－15］。

Chromobox 7（CBX7）蛋白是Poly Colnb家族一員；Polycomb group（PcG）蛋白家族是基因調(diào)控決定細(xì)胞命運(yùn)的組成部分，它被認(rèn)為能通過(guò)下調(diào)INK4a／ARF腫瘤抑制因子的表達(dá)控制細(xì)胞增殖，它的紊亂能夠?qū)е履[瘤發(fā)生［16－17］。CBX7（ehromobox homolog 7）主要分布于染色質(zhì)、核，其分子功能通過(guò)與染色質(zhì)結(jié)合實(shí)現(xiàn)。目前已有研究表明CBX7在腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，但不同腫瘤中CBX7表達(dá)情況與腫瘤的惡性程度的關(guān)系有不同表現(xiàn)，部分腫瘤CBX7高表達(dá)提示腫瘤惡性程度高，在另外的腫瘤則相反［18－20］。

實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)EZH2和CBX7在50例人皮膚血管瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中EZH2的含量明顯高于退化期和正常皮膚組織 （P＜0.05），這提示了EZH2作為一個(gè)新的癌基因，在血管瘤的增殖期高表達(dá)，表現(xiàn)為刺激血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤形成。這一過(guò)程分別受到腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移促進(jìn)相關(guān)基因和轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因的調(diào)控。而CBX7在增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中也呈高表達(dá)，提示CBX7與腫瘤細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，推測(cè)其可能成為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)記物和潛在治療靶點(diǎn)。我們并且分析EZH2和CBX7在增生期血管瘤組織中都呈高表達(dá)，兩者關(guān)系密切，在EZH2蛋白高表達(dá)的組織中CBX7組織也呈高表達(dá)。提示EZH2和CBX7可能共同促進(jìn)血管瘤的發(fā)生和發(fā)展。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 增生期血管瘤EZH2的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），EZH2表達(dá)強(qiáng)，S－P×200

圖2 退化期血管瘤EZH2的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），EZH2表達(dá)弱，S－P×200

圖3 正常皮膚組織EZH2的表達(dá) 正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有少量的棕黃色顆粒（→），EZH2表達(dá)弱，S－P×200

圖4 增生期血管瘤CBX7的表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），CBX7表達(dá)強(qiáng)，S－P×200

圖5 退化期血管瘤CBX7的表達(dá) 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒，CBX7表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)（→），S－P×200

圖6 正常皮膚組織CBX7的表達(dá) 正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有少量的棕黃色顆粒（→），CBX7表達(dá)弱，S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 EZH2 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of pro－liferating endothelial cells，EZH2 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.2 EZH2 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.3 EZH2 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.4 CBX7 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，CBX7 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.5 CBX7 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.6 CBX7 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200