自噬在狼瘡腎炎足細胞中的作用研究進展①

郭傲揚 邢 倩 （青島大學附屬青島市市立醫(yī)院風濕免疫科，青島266071）

自噬是依賴溶酶體途徑高度保守的細胞降解過程，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細胞存活至關重要，適度自噬在細胞中發(fā)揮保護作用，過度自噬會導致細胞損傷［1］。有證據(jù)表明自噬在維持腎臟穩(wěn)態(tài)和自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2-3］。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者早期腎臟受累通常預后不良，盡管積極應用抗炎及免疫抑制治療，很多狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）患者仍發(fā)展為慢性腎臟病或終末期腎?。?］。足細胞通過抵抗腎小球內(nèi)高靜水壓并形成分子篩來維持腎臟超濾功能，作為腎小球濾過屏障，足細胞損傷與蛋白尿密切相關，而足細胞的丟失會導致腎小球硬化［5-7］。足細胞是高度分化的細胞，其再生能力非常有限，在基礎狀態(tài)下，足細胞自噬水平較高，且自噬是防止足細胞損傷的關鍵［8］。LN 發(fā)病機制復雜，研究表明足細胞損傷在LN 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］。本文對自噬在LN 足細胞作用中的最新研究進展予以綜述。

1 足細胞中自噬概述

自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。其中針對巨自噬的研究最多，本文所述的自噬即巨自噬。自噬由自噬相關基因（autophagy-related?gene，ATG）調(diào)控。在饑餓、低氧、藥物等因素作用下，待降解的細胞成分包裹在雙層分隔膜中，隨后分隔膜逐漸延伸，最終待降解的成分被雙膜囊泡包裹形成自噬體，自噬體通過微管系統(tǒng)運輸至溶酶體融合形成自噬溶酶體［10］。自噬體在溶酶體內(nèi)降解，供給細胞新的成分和能量，與此同時溶酶體通過自噬溶酶體再造重新生成。自噬溶酶體伸出管狀結構釋放出原溶酶體小囊泡，這些小囊泡最終獲得酸性和溶酶體腔蛋白而成熟為新生溶酶體，自噬溶酶體再造可恢復游離溶酶體水平，在自噬末期維持溶酶體穩(wěn)態(tài)［11］。最終受損或多余胞質(zhì)內(nèi)容物被降解重新利用，溶酶體回歸正常，細胞度過危險回歸穩(wěn)態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)正常足細胞內(nèi)存在自噬泡，晚期自噬抑制劑氯喹促進微管相關蛋白輕鏈3（LC-3）Ⅱ表達，說明足細胞內(nèi)自噬的高活性；內(nèi)毒素誘導足細胞損傷，自噬激活劑雷帕霉素可減輕內(nèi)毒素對足細胞的損傷，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）可加重損傷［12］。特異性敲除ATG5 基因的小鼠表現(xiàn)為足細胞丟失和遲發(fā)性腎小球硬化，且更易罹患腎小球疾病［13］。以上研究表明細胞自噬激活對足細胞穩(wěn)態(tài)至關重要。

2 LN足細胞中的自噬

2.1 LN 自噬相關基因 目前，基因組廣泛關聯(lián)研究（GWAS）已發(fā)現(xiàn)100多個與SLE發(fā)病相關的基因，其中一些自噬相關基因，如：ATG5、CDKN1B、

DRAM1、CLEC16A、ATG16L2、ATG7、IRGM、LRRK2、MAP1LC3B、MTMR3、APOL1 與SLE 易 感 性 相關［14-15］；APOL1、MTMR3 和ATG5 的單核苷酸多態(tài)性與腎臟受累有關［16-17］。不同的基因多態(tài)性可導致不同的異常自噬，這些基因多態(tài)性不僅奠定了LN 患者自噬異常的基調(diào)，還影響了LN的嚴重程度。

2.1.1 ATG5 一項來自意大利的涉及315 例SLE患者和265 例健康人的隊列研究發(fā)現(xiàn)，在ATG5 的3 個等位基因（rs573775、rs6568431 和rs2245214）中，rs6568431 變異的等位基因與罹患LN 高風險相關，進一步發(fā)現(xiàn)rs6568431 中的ATG5 mRNA 表達更高［16-18］。在中國人群中發(fā)現(xiàn)ATG5 罕見變異體的頻率在LN 和SLE 中增加［19］，可見罕見的ATG5 變異體在中國狼瘡患者中的重要作用。

2.1.2 APOL1 APOL1 是人血清錐蟲分解因子，通過靶向錐蟲的溶酶體和線粒體膜，并觸發(fā)膜的去極化殺滅錐蟲體［20］。非洲人群中存在APOL1 的兩個變異體，即G1（rs73885319）和G2（rs71785313），當人體存在這兩個風險基因時，抵抗錐形蟲的能力增強，但自噬受到抑制，降低細胞抵抗不利影響的能力［21］。G1/G2 風險等位基因與腎小球疾病相關，與歐洲裔美國人相比，非裔美國SLE 患者更易進展為LN，并在具有APOL1 風險基因型的SLE 患者中發(fā)現(xiàn)LN相關的終末腎病發(fā)生得更早［22］。

2.1.3 MTMR3 MTMR3 是磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）磷酸酶的一種，這些磷酸酶與磷脂酰激酶相互調(diào)節(jié)PI3P 細胞水平，參與自噬的起始并控制自噬體大?。?3］。在中國北方漢族人群中發(fā)現(xiàn)MTMR3 的rs9983A 變異體與LN 風險密切相關［24］。表達分析顯示，具有這種變異的血液樣品和LN 患者腎臟活檢樣品中的MTMR3 轉(zhuǎn)錄水平較低。血清MTMR3表達與C3、C4 和尿蛋白水平呈負相關，敲除肌管蛋白，MTMR3 和MTMR14 與LC3-Ⅱ水平升高有關［25］。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，在SLE 中，MTMR3 的rs1253 變異可能通過影響miR-181a 和MTMR3 間的相互作用導致自噬增加，從而加重病情［26］。

2.2 LN足細胞中影響自噬的重要調(diào)節(jié)分子

2.2.1 哺乳動物雷帕霉素蛋白靶蛋白（mTOR）mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞生長和增殖中發(fā)揮核心作用［27］。mTOR 激酶與不同蛋白質(zhì)形成復合物，分別稱為mTOR 復合物1（mTORC1）和mTOR 復合物2（mTORC2），mTORC1 對雷帕霉素更敏感，自噬激活劑雷帕霉素通過抑制mTOR 促進自噬［28］。當細胞中缺乏營養(yǎng)物質(zhì)時，mTOR 表達降低，Ⅲ類磷脂酰肌醇3 激酶（classⅢPI3K）和ULK1 激活促進細胞自噬［29］。細胞和動物實驗已有明確證據(jù)表明雷帕霉素可有效治療LN。雷帕霉素治療后的小鼠腎炎減輕，抗雙鏈DNA 抗體滴度和腎臟中IgG的沉積降低［30］。LN 患者血清IgG 抗體和IFN-α分別通過活性氧和mTORC1 影響小鼠腎臟足細胞自噬，使用雷帕霉素后可進一步增強自噬，減輕小鼠足細胞損傷［31］。另外，一些靶向mTOR 的小編碼RNA 如miR-183 也可改善LN 小鼠的疾病進展，深入發(fā)掘這類小編碼RNA 在LN 診治中的作用具有廣泛前景［32］。PI3K/Akt/mTOR 異常激活是LN 的病理狀態(tài)之一。LN患者腎臟組織中B細胞活化因子（BAFF）、p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 的mRNA 和蛋白水平顯著增加，且LN 患者腎臟組織中BAFF mRNA 和蛋白水平與p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 水平呈正相關［33］。雷帕霉素對PI3K/Akt/mTOR 通路也可產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用［34］。雷帕霉素潛在的治療作用不僅可以阻斷mTOR，還能對LN中的致病通路產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用。

2.2.2 鈣和維生素D 臨床觀察到狼瘡患者往往由于日光照射不足、疾病活動、糖皮質(zhì)激素的使用等原因發(fā)生血清Ca2+降低。研究證明，游離Ca2+減少導致自噬抑制，細胞內(nèi)外Ca2+螯合劑均可抑制自噬，但抑制Ca2+依賴的蛋白激酶對自噬作用很小，而游離Ca2+減少可導致自噬抑制［35］。提示血清游離Ca2+對自噬的重要影響。維生素D不僅促進人體腸道對鈣、磷的吸收，還可提高人體免疫力。YU 等［36］研究證實維生素D 可改善足細胞功能并減少狼瘡IgG處理的足細胞中的自噬，但維生素D對自噬的作用尚不明確。更有說服力的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D 介導的保護無法改善選擇性Atg7 敲除小鼠受到的紫外線照射損傷，提示維生素D 通過增加而不是減少自噬而減輕有害因素的損傷［37］。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3 可通過cathelicidin 誘導人單核細胞/巨噬細胞自噬［38］。鑒于Ca2+缺乏在患者中的廣泛存在和維生素D 的廣泛使用，深入研究維生素D 和Ca2+對自噬的作用機制具有重大意義。

2.2.3 p53 腫瘤抑制因子p53 與自噬關系密切。DNA損傷或缺氧等因素可激活腫瘤抑制因子p53調(diào)節(jié)細胞周期、分化、凋亡、衰老和自噬［39］。DNA 受損時，p53啟動修復受損DNA，同時自噬通過形成自噬體包裹細胞內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)，自噬溶酶體降解自噬體內(nèi)容物提供DNA 修復原料和大量的能量修復DNA，最終p53 表達減少［31］。而突變的p53 蛋白通過阻遏關鍵自噬相關蛋白和酶，如：BECN1（和PBECN1）、DRAM1、ATG12、SESN1/2 和P-AMPK，可顯著抵消自噬囊泡的形成及其與溶酶體的融合，抑制自噬通量促進胰腺和乳腺癌細胞增殖，mTOR 抑制劑依維莫司可改善病情［40］。臨床觀察到活動期SLE 患者外周血單個核細胞中的p53 和血清p53 抗體表達顯著高于健康對照，研究發(fā)現(xiàn)，健康人群中不存在p53 抗體，SLE 患者中存在p53 抗體，且活動期高于穩(wěn)定期，LN 中p53 抗體血清陽性率較SLE 的其他表現(xiàn)更為突出［41］。后續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者產(chǎn)生的抗DNA 和p53 抗體可在功能上阻斷p53 激活，且缺乏p53下游效應蛋白Gadd45a和p21會誘導小鼠發(fā)展為狼瘡樣綜合征［42-43］。足細胞可攝取SLE自身抗體［44］，因此推測p53 蛋白抗體和抗DNA 抗體進入足細胞后，足細胞DNA受損，DNA修復被抑制，自噬因而被激活，激活的自噬有助于足細胞存活。

2.3 LN不同病理類型中的足細胞自噬 既往研究表明LN 足細胞存在不同的自噬狀態(tài)。ZHOU 等［45］發(fā)現(xiàn)足細胞中自噬激活最明顯，QI 等［31］發(fā)現(xiàn)在LN小鼠和狼瘡患者腎臟活檢樣品中，腎臟固有細胞中只有足細胞可檢測到自噬激活。狼瘡患者血清中IgG 抗體和IFN-α 是導致LN 足細胞受損的關鍵因子，大量研究認為激活的自噬保護了LN 足細胞免受患者血清中IgG 抗體和IFN-α 誘導的損傷［31，36］。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，LN 患者的IgG 和IFN-α 可通過產(chǎn)生活性氧或激活mTORC1 影響鼠和人足細胞自噬，使用3-MA 和shATG5 抑制自噬后，足細胞損傷加重，自噬激活劑雷帕霉素促進自噬改善了上述癥狀［31］。足細胞的自噬能力對其在LN 致病環(huán)境中的存活具有作用。

2.3.1 Ⅲ型、Ⅳ型 Ⅲ型和Ⅳ型狼瘡患者腎臟足細胞中自噬體明顯多于對照組和Ⅱ、Ⅴ型LN 患者，且自噬體在Ⅲ、Ⅳ型LN 患者間無顯著差異，足細胞自噬體數(shù)量和LC3 蛋白表達在Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ-Ⅳ型LN 中逐漸升高且高于健康對照，Ⅴ-Ⅲ型足細胞中自噬體的數(shù)量雖然大于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義［46-47］。

2.3.2 Ⅱ型、Ⅴ型 與對照組相比，Ⅱ型和Ⅴ型LN患者中觀察到的自噬體更少，而Ⅲ、Ⅳ型LN 患者中檢測到的自噬體數(shù)量更多［31，47］。病理形態(tài)上，足細胞融合在Ⅱ型LN 中最高且高于Ⅰ型，但在Ⅲ型中忽然降低，然后從Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅴ+Ⅲ型、Ⅴ+Ⅳ型逐漸升高［47］。與上述發(fā)現(xiàn)相反，另有研究發(fā)現(xiàn)Ⅴ型腎炎足細胞中的自噬體增加，而Ⅲ、Ⅳ類狼瘡患者足細胞中檢測到的自噬體數(shù)量更少［36］。Ⅴ型LN是一種繼發(fā)性膜性腎?。╯econdary membranous nephropathy，SMN），SMN 可能從側面顯示了Ⅴ型LN 足細胞內(nèi)的自噬變化。有報道發(fā)現(xiàn)膜性腎病內(nèi)自噬減少，在原發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）中觀察到mTOR 激活，自噬體少于SMN，而雷帕霉素促進自噬可保護SMN 足細胞免受補體誘導的損傷［46，48-50］。Ⅴ型LN患者足細胞中的自噬體少于IMN 的現(xiàn)象提示Ⅴ型LN 足細胞中可能存在的更多的抑制自噬的因素值得關注。

2.4 與LN鑒別的其他腎炎中的足細胞自噬

2.4.1 膜性腎病 JIN 等［46］研究了15 例健康人、26 例IMN 患者（Ⅰ期14 例、Ⅱ期12 例）和15 例SMN（LN）患者，結果提示IMN 患者足細胞中自噬體減少，這一現(xiàn)象隨著病理分期從Ⅰ期到Ⅱ期呈加重趨勢，且Ⅴ型LN 患者足細胞中的自噬體少于IMN 患者。膜性腎病患者根據(jù)腎小球濾過率（eGFR）分為eGFR≥60 ml/min 和eGFR＜60 ml/min 兩組，eGFR 低則自噬體數(shù)量多［48］。膜性腎病的重要致病機制是補體激活，膜攻擊復合物在足細胞質(zhì)膜上組裝，最終導致足細胞損傷和蛋白尿。膜攻擊復合物可通過抑制溶酶體酸化、mTORC1 信號通路等抑制足細胞自噬［51-52］。使用3-MA 抑制自噬可加重補體攻擊復合物誘導的損傷［50］。氯喹可部分模擬膜攻擊復合物孵育的小鼠足細胞損傷，促進自噬可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和異常激活的mTORC 通路改善足細胞損傷［51-53］。綜上，膜性腎病足細胞中自噬被抑制，激活自噬在減輕膜性腎病足細胞損傷中發(fā)揮重要作用。

圖1 p53蛋白和mTORC1對狼瘡腎炎足細胞自噬的調(diào)控Fig.1 Regulation of p53 protein and mTORC1 on autophagy of podocyte in LN

2.4.2 糖尿病腎病 糖尿病腎病小鼠腎小球中足細胞和自噬體數(shù)量明顯減少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯降低，腹腔注射雷帕霉素后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，自噬功能恢復，蛋白尿減少［54］；同時也有研究在糖尿病腎病小鼠中發(fā)現(xiàn)足細胞中存在自噬激活，表現(xiàn)為高糖刺激下的足細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于低糖對照組，自噬蛋白ATG5 缺失可加速糖尿病引起的足底病變和腎小球硬化［55］。糖尿病腎病中存在活性氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等促進足細胞自噬的因素，同時高糖、過度營養(yǎng)使得mTOR、AMPK 過度活化等因素抑制自噬［56-59］。糖尿病腎病足細胞中存在的自噬低表達或高表達可能與細胞所處環(huán)境有關。隨著疾病進展，糖尿病腎病足細胞中的自噬被抑制，足細胞抵抗高糖損傷能力下降，而激活自噬可增強足細胞抵抗高糖所致?lián)p傷的能力，進而延緩病情進展。

3 展望

LN 是SLE 最常見的并發(fā)癥，自噬在LN 的發(fā)生發(fā)展及防治中具有重要意義，LN足細胞中存在自噬功能障礙，雖然自噬在LN 足細胞中是激活還是受阻仍存在爭議，但已有明確實驗證明調(diào)節(jié)自噬可改善足細胞損傷。臨床中治療LN 的常用藥物，如羥氯喹、雷帕霉素、他可莫斯等可作用于自噬，自噬激活劑和自噬抑制劑可能在疾病的不同階段作用于自噬的不同步驟影響疾病進展［60］。通過藥物靶向調(diào)節(jié)自噬可能成為研究熱點。細胞自噬的機制是一個復雜、動態(tài)的過程，對于自噬的觀察需要在多個維度用多種實驗方法驗證，其在足細胞凋亡和信號通路中的作用也還有很多疑問。近年來細胞自噬參與LN 足細胞損傷導致的蛋白尿的具體機制研究尚處于初期，深入研究自噬在LN 發(fā)生發(fā)展中的作用將為LN的診治提供新思路。