苦瓜ＤＮＡ提取方法的比較

摘要：采用ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法、試劑盒法４種方法提取苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）葉片基因組ＤＮＡ，并使用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取所得ＤＮＡ的純度和濃度。結(jié)果表明，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和試劑盒法提取的基因組ＤＮＡ純度高于ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法，其中ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ濃度和產(chǎn)率高于其他方法。

關(guān)鍵詞：苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）；ＤＮＡ提?。唬茫裕粒路?；ＳＤＳ法；ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法；試劑盒法

中圖分類號(hào)：Ｓ６４２．５；Ｑ５２３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）17－3866-03

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．

ＸＵ Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＬＩＵ Ｙａｎｇ

（Agricultural Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ

ＤＮＡ的提取質(zhì)量是分子生物學(xué)研究的前提，通常要求所提取的ＤＮＡ有較高的純度，完整且無(wú)斷裂、無(wú)降解，提取過(guò)程盡量少使用有毒化學(xué)品等［１，２］。植物的種類、采樣部位、采樣時(shí)期等都會(huì)對(duì)ＤＮＡ的提取效果造成影響［３－８］。本研究以苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）為材料，使用ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和試劑盒法提取基因組ＤＮＡ，并對(duì)提取效果進(jìn)行比較分析，以篩選出ＤＮＡ純度和產(chǎn)率都較高的提取方法，為苦瓜分子生物學(xué)的研究提供技術(shù)支持。

１ 材料與方法

１．１ 實(shí)驗(yàn)材料

供試苦瓜品種為碧翠苦瓜，種植于貴州大學(xué)農(nóng)場(chǎng)大棚，采集盛花期苦瓜幼嫩葉片，使用變色硅膠干燥后備用。

試劑ＣＴＡＢ、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ、ＰＶＰ、瓊脂糖等購(gòu)于Ｓｉｇｍａ公司；ＥＤＴＡ、氯化鈉、氯仿、異戊醇、硼酸、乙酸鉀、乙酸鈉、５×ＴＢＥ、１×ＴＥ等購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＲＮＡｓｅ購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；試劑盒Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。

１．２ 苦瓜ＤＮＡ的提取

１．２．１ ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法 ①稱?。埃?ｇ干燥的苦瓜嫩葉，加入２％的ＰＶＰ和少量的石英砂，液氮充分研磨。②將研磨成均勻粉狀的材料加入到７００ μＬ ２％ ＳＤＳ提取液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、２％ＰＶＰ，ｐＨ ８．０）中，并加入１００ μＬ β－巰基乙醇，振蕩混勻，于６５ ℃水?。?ｈ，期間每隔１０ ｍｉｎ上下顛倒離心管。③取出冷卻至室溫，加入０．８倍體積的５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ（ｐＨ ４．８），０ ℃冰浴１ ｈ，在４ ℃下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清。④加入０．４倍體積的２％ ＣＴＡＢ提取液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、 １．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、 ２％ ＣＴＡＢ、２％ ＰＶＰ，ｐＨ ８．０），充分混勻，６５ ℃水?。玻?ｍｉｍ。⑤冷卻至室溫后加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比２４∶１，下同）抽提３次，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清。⑥加入０．５倍體積的１．２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液和０．５倍體積預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，－２０ ℃放置１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，去上清。⑦用７０％的乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）洗滌沉淀２次，風(fēng)干沉淀，加５００ μＬ滅菌水溶解，然后加５０ μＬ ｐＨ ５．２的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ和２倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻，－２０ ℃放置１０ ｍｉｎ，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。⑧用７０％的乙醇洗滌沉淀２次，無(wú)水乙醇洗滌沉淀１次，自然風(fēng)干。⑨加入１００ μＬ ＴＥ緩沖液充分溶解沉淀，于－２０ ℃下保存。

１．２．２ ＣＴＡＢ法 ①稱?。埃?ｇ干燥的苦瓜嫩葉，加入１％的ＰＶＰ在液氮下快速研磨成粉待用。②將研磨好的材料迅速加入到５００ μＬ ６５ ℃充分預(yù)熱的２％ ＣＴＡＢ提取液中，并加入２０ μＬ β－巰基乙醇，充分振蕩混勻，在６５ ℃下水?。?ｈ，期間每隔１０ ｍｉｎ將離心管上下顛倒混勻。③取出后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿-異戊醇，上下顛倒混勻使其乳化，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。④吸取上清液于另一干凈的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，１～２ ｍｉｎ后出現(xiàn)白色絮狀沉淀。⑤挑出ＤＮＡ或低速離心后將沉淀轉(zhuǎn)移到盛有７５％乙醇的離心管中洗滌２次，加入ＴＥ溶解沉淀。⑥加入４～１０ μＬ ＲＮａｓｅ Ａ（約４０～１００ μｇ）于３７ ℃酶解３０ ｍｉｎ以除去樣品中含有的ＲＮＡ。⑦加入等體積的氯仿-異戊醇，混勻后１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液重復(fù)抽提２次。⑧加入４００ μＬ ５ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ，混勻后在冰上靜置３０ ｍｉｎ，然后１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液。⑨加入２倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后４ ℃放置２０ ｍｉｎ，然后６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，倒掉上清液，晾干。⑩將沉淀用７５％的乙醇洗滌２次后用無(wú)水乙醇洗１遍，抽干后加入１００ μＬ ＴＥ緩沖液溶解，保存于－２０ ℃冰箱中。

１．２．３ ＳＤＳ法 ①稱取０．２ ｇ干燥的苦瓜嫩葉，加入１％ ＰＶＰ，在液氮下快速研磨成粉待用。②將研磨好的材料迅速加入到８００ μＬ預(yù)熱至６５ ℃的２％ ＳＤＳ提取液中，并加入２０ μＬ β－巰基乙醇，輕輕攪動(dòng)，使粉末充分散開(kāi)，６５ ℃保溫１ ｈ，期間每隔１０ ｍｉｎ將離心管上下顛倒混勻。③取出冷卻至室溫，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心１０ ｍｉｎ，取上清液。④加入０．８倍體積ｐＨ ４．８的５．０ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ，充分混勻后０ ℃冰?。?ｈ，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液。⑤加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，直至形成的乳狀液不再快速分層，放置片刻，４℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心１０ ｍｉｎ，取上清。⑥加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，－２０ ℃放置３０ ｍｉｎ或過(guò)夜，４ ℃、６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，倒掉上清，用７０％的乙醇洗滌沉淀２次后用無(wú)水乙醇洗沉淀２次，自然風(fēng)干。⑦加入１００ μＬ ＴＥ緩沖液，充分溶解沉淀，于

－２０ ℃下保存。

１．２．４ 試劑盒法 稱?。埃?ｇ干燥的苦瓜嫩葉，使用試劑盒Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ提取基因組ＤＮＡ，此試劑盒法基本原理是氯化芐法，提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

１．３ ＤＮＡ質(zhì)量與濃度檢測(cè)

１．３．１ 分光光度法 取提取所得ＤＮＡ １０ μＬ，稀釋２００倍，以ＴＥ緩沖液作為空白對(duì)照，測(cè)定各個(gè)樣品在２６０、２３０及２８０ ｎｍ波長(zhǎng)處的吸光度，檢測(cè)所提取樣品ＤＮＡ的純度和濃度，計(jì)算ＤＮＡ產(chǎn)率，每個(gè)樣品重復(fù)１０次取平均值。

ＤＮＡ產(chǎn)率（μｇ／ｇ）＝ＤＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）×提取液體積（ｍＬ）×稀釋倍數(shù)／原材料質(zhì)量（ｇ）

１．３．２ 瓊脂糖凝膠電泳 取５ μＬ ＤＮＡ提取液，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳，ＥＢ染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 提取所得苦瓜基因組ＤＮＡ的純度檢測(cè)結(jié)果

用ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、試劑盒法提取苦瓜基因組ＤＮＡ，采用分光光度法檢測(cè)提取產(chǎn)物的純度，結(jié)果見(jiàn)表１。由表１可知，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和試劑盒法提取得到的ＤＮＡ Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ分別為１．８９２和１．９７３；而ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取得到的ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ都在１．７左右，說(shuō)明ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取的樣品中可能還有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和試劑盒法的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２３０ ｎｍ分別為２．０１７和２．１３６，而ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法所提樣品Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２３０ ｎｍ小于２，說(shuō)明樣品中可能有碳水化合物、多肽等一些小分子物質(zhì)未被除凈。從所提取的ＤＮＡ純度來(lái)看，試劑盒法最優(yōu)，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和ＣＴＡＢ法次之，ＳＤＳ法最差；從ＤＮＡ的濃度和產(chǎn)率來(lái)看，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和ＣＴＡＢ法最高，其次是CTAB法，ＳＤＳ法和試劑盒法較低。

２．２ 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)４種方法提取的苦瓜基因組ＤＮＡ，結(jié)果如圖１。從圖１可以看出，提取所得ＤＮＡ條帶明亮清晰，均無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明這４種方法都能提取相對(duì)完整的ＤＮＡ，未出現(xiàn)明顯的降解。但ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ在點(diǎn)樣孔內(nèi)有雜質(zhì)殘留，說(shuō)明這些樣品中含有未被去除的蛋白質(zhì)、多糖等，這些物質(zhì)與ＤＮＡ粘連形成復(fù)合物，使部分ＤＮＡ無(wú)法離開(kāi)點(diǎn)樣孔或電泳速度較慢，而其他兩種方法點(diǎn)樣孔內(nèi)雜質(zhì)較少。各種方法中試劑盒法提取的ＤＮＡ濃度較低，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ濃度最高。

３ 小結(jié)與討論

于華會(huì)等［９］研究表明，硅膠干燥和－７０ ℃超低溫保存的樣品與鮮葉相比，所提ＤＮＡ的質(zhì)量無(wú)明顯差異，均能滿足ＰＣＲ擴(kuò)增的要求?？喙先~片相對(duì)較薄，含水量大，容易氧化褐變，所以采樣后先用變色硅膠進(jìn)行干燥，有利于ＤＮＡ的提取。苦瓜新鮮葉片中含有較多多酚類物質(zhì)，提?。模危?xí)r容易發(fā)生褐變。在研磨過(guò)程中加入β－巰基乙醇可以有效地降低細(xì)胞的氧化損傷，ＰＶＰ則可與酚類物質(zhì)結(jié)合形成螯合物，通過(guò)離心除去［１０］，從而減少褐變。但ＰＶＰ和β－巰基乙醇單獨(dú)使用效果并不理想，將二者按照一定比例配合使用較好［１１］，所以在本研究中ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法都使用了ＰＶＰ和β－巰基乙醇相結(jié)合的方法來(lái)防止褐變，取得了不錯(cuò)的效果。ＣＴＡＢ和ＳＤＳ是去污劑［１２］，既能溶解細(xì)胞膜，又能較好地去除多糖的干擾，相對(duì)而言ＣＴＡＢ去除多糖的能力比ＳＤＳ要強(qiáng)，但是ＤＮＡ的得率較低，所以ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法相結(jié)合能得到高純度高濃度的ＤＮＡ。同時(shí)，在高濃度Ｎａ＋或Ｋ＋存在的條件下，通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖、蛋白質(zhì)［１２］。

本研究使用４種方法提?。模危?，結(jié)果表明，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和試劑盒法提取的ＤＮＡ純度高于ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法，其中ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取所得ＤＮＡ的濃度和產(chǎn)率高于其他３種方法。

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