細綠萍黑腐病病原菌鑒定及其生物學特性和防治藥劑篩選

木扎帕爾·吐魯洪,烏漢夫,侯 雨,初熒熒,劉 傳,霍美竹,崔國文

(東北業(yè)大學動物科學技術學院,黑龍江 哈爾濱 150036)

細綠萍(AzollafiliculoidesLamk)是滿江紅科(Azollaceae)滿江紅屬(Azolla)蕨類水生植物[1]。從德國引入我國,國內分布在長江流域各省,由于細綠萍的抗寒性好,在5℃時開始生長,在氣溫-8℃時,短期也不會發(fā)生凍害而死亡,因此在東北三省開始引種試驗[2-3]。細綠萍畝產高且生長速度快,氣溫20℃時2-3天萍產量可翻倍,飼草的營養(yǎng)價值高,適口性好,可以不經過加工就作為飼料給家畜投喂。細綠萍具有巨大的市場潛力和產品競爭力,不僅可以在湖泊、沼澤、池塘等天然水面生長良好,也可以在屋前屋后等空曠場所的簡易池塘中種植,不占用耕地,草量大,2畝水面的細綠萍產量可養(yǎng)殖100頭豬,1畝水面可養(yǎng)殖200只鵝,并且可滿足夏季4個月的草料需求。細綠萍營養(yǎng)價值豐富,產草量極高,在東北110～125天生長期內,鮮草產量可高達5.4×105～9.75×105kg·hm-2;干物質含量27.94%,粗蛋白14.14%,是豬、禽類和魚等的優(yōu)良飼草[4-5]。作為優(yōu)良的飼草品種,具有固氮能力強且營養(yǎng)全面等特點,細綠萍中豐富的維生素和礦物質可以改善家禽的免疫力并促進生長發(fā)育,提高畜禽品質,增強抗病能力[6-9]。細綠萍在農業(yè)生產中可以作為優(yōu)質綠肥,細綠萍可充分吸收水分和光照來增加土壤有機質來增加作物產量[10-11]。細綠萍不僅可以作為優(yōu)質飼草,在水質凈化上也起到良好的作用,對含有重金屬的工業(yè)廢水的凈化能力很強,凈化后的水可接近灌溉水的標準[12-13]。因此,細綠萍的飼用價值和生態(tài)學價值很高,開發(fā)潛力很大。隨著細綠萍的廣泛推廣種植,導致病原微生物開始蔓延擴散,致使細綠萍出現(xiàn)發(fā)黑腐爛的病癥,而明確引起細綠萍黑腐病的病原菌種類是防治該病害的關鍵。

本研究對細綠萍植株中分離獲得的黑腐病病原菌--細極鏈格孢(Alternariatenuissima(Kunze) Wiltshire)進行分離鑒定、生物學特性和室內毒力測定的研究,以期為今后細綠萍黑腐病的診斷和防治提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗病原菌為本實驗室2022年從黑龍江省哈爾濱市細綠萍培育田中染病的龍引細綠萍中經組織分離并純化所得,回接植物為東北農業(yè)大學培育的龍引細綠萍。

1.2 病原菌的分離與純化

在實驗室條件下,采用常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離[14]。將采集到的細綠萍孢子病樣用蒸餾水沖洗干凈,自然晾干。在超凈工作臺上,用手術刀切取病健交界處的組織塊,并將其置于75%乙醇中浸泡消毒30 s,再將其放入0.1%的升汞溶液中2 min,用無菌水漂洗3次后,放置在已滅菌的濾紙上,待樣品表面水分自然晾干,最后將樣品放在pH值為7.0的PDA培養(yǎng)基中,25℃條件下避光培養(yǎng)3-5 d。待組織塊長出菌落后,采用單胞分離法進行純化培養(yǎng)[15],并將純化后的分離物接種于PDA斜面上培養(yǎng)好后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的致病性測定與再分離

將病原菌在PDA培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)7 d后,根據資料所描述的方法配制孢子懸浮液備用[16]。稱取25 g細綠萍裝入容器中,水和孢子懸浮液以9∶1的混合,對照組加入同等量的無菌水,25℃保濕培養(yǎng)7 d期間觀察并記錄細綠萍發(fā)病情況。對于回接后的具有明顯病癥的區(qū)域進行致病菌分離,再次純化培養(yǎng),觀察并記錄再次分離的菌株和初始菌株之間的差異,完成柯赫式氏法則驗證。

1.4 病原菌形態(tài)學鑒定

將病原菌在PDA培養(yǎng)基上恒溫25℃培養(yǎng)7 d后,觀察其菌落長勢情況,菌落大小和顏色,在光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài),分生孢子的大小、形態(tài)特征和著生方式,參照文獻[17-20]確定病原菌種類。

1.5 病原菌的分子生物鑒定

將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上,在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)7 d后,刮取菌落中約150 mg的菌絲,采用NuClean Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取病原菌DNA,以提取的DNA作為PCR模板,分別用ITS、EF-1α和Histone H3三種通用引物(引物見表1)對提取的DNA進行PCR擴增。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖檢測后由生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果通過Blast在NCBI數據庫中比對,進行同源比對。

表1 病原菌的ITS,EF-1α和HIS H3基因的PCR擴增引物Table 1 PCR primers for amplifying ITS,EF-1α and Histone H3 genes of the pathogen

1.6 病原菌的生物學特性的研究

1.6.1不同溫度、光照及pH值對菌絲生長和產孢量的影響 將病原菌置于25℃恒溫培養(yǎng)7 d后,使用直徑5 mm的無菌打孔器在菌落邊緣打取若干個菌餅,接種于以下不同條件下的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng):溫度條件設置為5,10,15,20,25,30,35,40℃共8個溫度梯度恒溫暗培養(yǎng);光照條件設置為全天光照(Light,L)、全天黑暗(Dark,D)、半天光照和半天黑暗(12L/12D)共3種處理25℃恒溫暗培養(yǎng);使用pH計和配置好的1% NaOH和1% HCl母液,將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調至4,5,6,7,8,9,10,11 共8個梯度25℃恒溫暗培養(yǎng),以上每種處理條件設置3個重復,7 d后采用十字交叉法對菌落直徑進行測量,并利用血球計數板計算產孢量,每組重復3次。

1.6.2不同培養(yǎng)基對菌絲生長及產孢量的影響 供試培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基(WA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA),查比克培養(yǎng)基(CDA),燕麥培養(yǎng)基(OMA),玉米粉培養(yǎng)基(CMA)[21]。使用直徑5 mm的無菌打孔器在培養(yǎng)7 d的病原菌菌落邊緣打取若干個菌餅,并將菌餅分別轉接到供試的幾種培養(yǎng)基平板中央,每種培養(yǎng)基設置3個重復,25℃條件下按暗培養(yǎng)7 d。按照上文描述的方法測定并計算病原菌的生長速率和產孢量。

1.6.3不同碳源對菌絲生長及產孢量的影響 以CDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,分別用相同質量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、羥基纖維素鈉、丙三醇、和D-甘露醇代替其中的蔗糖,配成不同碳源的培養(yǎng)基,以不加蔗糖培養(yǎng)基作為缺碳對照。按照上文描述的方法測定并計算病原菌的生長速率和產孢量。

1.6.4不同氮源對菌絲生長及產孢量的影響 以CDA培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基,分別用相同質量的硫酸胺、胰蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫銨、酵母浸膏、尿素代替其中的硝酸鉀,配成不同氮源的培養(yǎng)基,以不加硝酸鉀培養(yǎng)基作為缺氮對照。按照上文描述的方法測定并計算病原菌的生長速率和產孢量。

1.7 病原菌室內藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法[22]對5種藥劑進行室內毒力測定。將藥劑按照濃度稀釋配置,詳細濃度見表2。5種藥劑分別稀釋成5個不同濃度梯度,將其放入到滅菌處理完畢融化的PDA培養(yǎng)基中,調制成藥劑比1∶9的帶藥培養(yǎng)基,混勻倒入培養(yǎng)皿中,待其冷卻后用5 mm打孔器在事先準備好的致病菌培養(yǎng)皿上打取若干菌餅,每個帶藥培養(yǎng)皿中央放置1塊菌餅,重復5次,以不加藥劑的培養(yǎng)基作為對照。放置在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑大小,計算藥劑對病菌的抑制情況。

表2 5種殺菌劑的濃度Table 2 Concentrations of five fungicides

1.8 數據分析

試驗數據采用SPSS 22.0和Excel 2016進行統(tǒng)計分析及作圖,對試驗數據進行鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性分析,并以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 細綠萍黑腐病病原菌分離和致病性檢測

在細綠萍養(yǎng)殖田中調查發(fā)現(xiàn),與健康孢子相比(圖1A),發(fā)病初期細綠萍孢子由黃褐色變成黑褐色,呈點狀分布,逐步向周邊蔓延(圖1B)。隨著細綠萍孢子不斷被侵染,大范圍細綠萍逐漸開始病變,最后使植株腐爛發(fā)臭,一部分孢子黃化干枯(圖1C),從而致使整株死亡,使得細綠萍失去飼用和經濟價值。通過常規(guī)組織分離法對30份發(fā)病細綠萍黑腐病樣進行分離并純化,得到10個形態(tài)一致的菌落,純化培養(yǎng)后的分離物合編號為XLP1-XLP10,將代表菌株XLP1接種于活體細綠萍孢子7 d后,觀察到細綠萍孢子發(fā)黑,其中還伴隨著部分菌絲包裹細綠萍孢子,發(fā)病癥狀顯著(圖1D～1F)。但與田間發(fā)病癥狀有所區(qū)別,這可能是因為實驗環(huán)境與田間環(huán)境之間差別造成的。對活體回接后的發(fā)病病樣再次分離后,獲得的菌落形態(tài)與XLP1一致,經過柯赫氏法則可以確定菌株XLP1為細綠萍黑腐病的病原菌。

圖1 田間和實驗室條件下細綠萍黑腐病的癥狀Fig.1 Symptoms of Azolla filiculoides black rot under field and laboratory conditions注:圖A,D表示健康孢子;圖B,C表示田間黑腐病癥狀;圖E,F表示致病性檢驗癥狀Note:Panel A and D,health spore;Panel B and C,symptoms of the black rot in the field;Panel E and F,pathogenicity verification symptoms

2.2 病原菌的形態(tài)學鑒定

將菌株XLP1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后即可長滿全皿,菌落正面最初為灰白色,具有豐富的棉狀氣生菌絲,然后變?yōu)樯罨疑?菌落底部呈現(xiàn)棕灰色(圖2A)。利用光學顯微鏡觀察形態(tài)特征,分生孢子通常是呈倒棒狀至倒梨狀或橢圓形,有1～6個橫隔和0～3個縱隔,橫隔較厚,頂端有一個短喙。分生孢子淡褐色,呈鏈狀,長度測量值為11.7至46.3×5.5至15.1 μm(n=50)(圖2B～2C)。根據Yu等[23]對鏈格孢菌屬的形態(tài)描述,并結合菌株的形態(tài)學鑒定結果,初步確定菌株XLP1為鏈格孢菌屬(A.tenuissima)真菌。

圖2 菌落的形態(tài)特征,菌絲和分離株的分生孢子Fig.2 Morphological characteristics of the colony,hyphae and conidia of the isolates注:A,菌落;B,分生孢子;C,菌絲Note:Panel A,Colony;Panel B,Conidia;Panel C,Hyphae

2.3 病原菌的分子生物學特征

從獲得的10個分離株中挑選有代表性的3個菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析(XLP1-XLP3)。將3個DNA片段(ITS,EF-1α和Histone H3)結合基因比對數據建立多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)。每個分離物的三個PCR片段的序列保存在GenBank中,其中ITS基因序列與細極鏈格孢(登錄號:MF405157)同源性達到100%(登錄號:OQ474944,OQ474911,OQ474912),EF-1α基因序列與細極鏈格孢(登錄號:ON237475)同源性達到99%(登錄號:OQ538182,OQ538187,OQ5381 86),Histone H3基因序列與細極鏈格孢(登錄號:ON352101)同源性達到100%(登錄號:OQ538 183,OQ538185,OQ538184)且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起。因此,結合形態(tài)特征將這3個菌株鑒定為細極鏈格孢。

圖3 基于ITS,EF-1α和Histone H3序列的3個分離株的聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育關系Fig.3 Combined gene phylogenetic relationships of three isolates of Alternaria tenuissima based on ITS,EF-1α and Histone H3 sequences

2.4 生物學特性

2.4.1溫度對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同溫度條件下菌株XLP1的菌落直徑和產孢量如圖4所示。在不同溫度條件下,菌株XLP1菌落直徑和產孢量均有顯著差異(P<0.05)。最適菌絲生長溫度為25℃,培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑達到89.33 mm,當溫度為40℃時幾乎不生長,而在低溫條件下依然能較好的生長。溫度條件在20℃～30℃時,可產生較多孢子,產孢的最適溫度為25℃,培養(yǎng)7 d后每毫升培養(yǎng)基上產孢量為6.50×105。

圖4 不同溫度對XLP1菌絲生長和產孢量的影響Fig.4 Effect of different temperatures on mycelial growth and sporulation of XLP1注:不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05),下同Note:Different lowercase letters within the same panel indicate a significant difference between different temperature treatments at the 0.05 level,the same as below

2.4.2光照對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同光照條件下菌株XLP1的菌落直徑和產孢量如圖5所示。在不同溫度條件下,菌株XLP1菌落直徑和產孢量均有顯著差異(P<0.05)。全黑暗的條件更有利于菌絲的生長和產孢,全黑暗培養(yǎng)7 d后菌落直徑可達74.17 mm,每毫升培養(yǎng)基上產孢量為6.25×105。而在全光照培養(yǎng)條件下每毫升培養(yǎng)基上產孢量最少,為3.50×105。

圖5 不同光照條件對XLP1菌絲生長和產孢量的影響Fig.5 Effect of different light conditions on mycelial growth and sporulation of XLP1

2.4.3pH對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同培養(yǎng)基pH條件下菌株XLP1的菌落直徑和產孢量如圖6所示。在pH值為3～11的培養(yǎng)基上,菌株XLP1的菌絲均可生長,最適宜菌絲生長和產孢的培養(yǎng)基pH值均為6～8。當培養(yǎng)基pH值為7時,每毫升培養(yǎng)基上產孢量最高,可到達6.24×105。而總體來看偏酸或偏堿環(huán)境下病原菌都能生長。

圖6 不同pH條件對XLP1菌絲生長和產孢量的影響Fig.6 Effect of different pH conditions on mycelial growth and sporulation of XLP1

2.4.4培養(yǎng)基對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同培養(yǎng)基上菌株XLP1的菌落直徑和產孢量分別如圖7所示。菌株XLP1在6種供試培養(yǎng)基上均可生長,不同種類的培養(yǎng)基對菌株XLP1菌落直徑和產孢量均有顯著差異。病原菌菌絲在WA和PSA培養(yǎng)基上生長速度較慢,其中在WA培養(yǎng)基中菌絲最稀疏,在PDA,CDA,OMA和CMA培養(yǎng)基上生長速度相對較快,其中在CMA培養(yǎng)基上生長速度最快,培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑可達88.67 mm。病原菌在PSA培養(yǎng)基上產孢量最大,培養(yǎng)7 d后每毫升培養(yǎng)基上產孢量可達9.06×105,在WA培養(yǎng)基上產孢量較低。因此,可以推測既沒有碳源,也沒有氮源的情況下病原菌菌絲無法生長,且?guī)缀醪划a孢。

圖7 不同培養(yǎng)基對XLP1菌絲生長和產孢量的影響Fig.7 Effect of different media on mycelial growth and sporulation of XLP1

2.4.5碳源對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同碳源條件下菌株XLP1的菌落直徑和產孢量如圖8所示。7種碳源對菌株XLP1的菌落直徑和產孢量的影響存在顯著差異。以丙三醇作為碳源時,病原菌菌絲的生長速度最快,培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑可以達到70.33 mm,而以羥基纖維素鈉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最慢,菌落平均直徑為47.33 mm。以甘露醇作為碳源時,病原菌的產孢量最大,培養(yǎng)7 d后每毫升培養(yǎng)基上產孢量為6.83×105,而以可溶性淀粉為碳源的每毫升培養(yǎng)基上產孢量最少,為1.71×105。

圖8 不同碳源對XLP1菌絲生長及產孢量的影響Fig.8 Effect of different carbon sources on mycelial growth and sporulation of XLP1注:C1,蔗糖;C2,麥芽糖;C3,葡萄糖;C4,羥基纖維素鈉;C5,可溶性淀粉;C6,甘油;C7,甘露醇;C8,對照Note:C1,Saccharose;C2,Maltose;C3,Glucose;C4,Sodium hydroxycellulose;C5,Soluble starch;C6,Glycerol;C7,Mannitol;C8,CK

2.4.6氮源對病原菌菌落直徑和產孢量的影響 不同氮源條件下菌株XLP1的菌落直徑和產孢量如圖9所示。7種氮源對菌株XLP1的菌落直徑和產孢量的影響存在顯著差異。以硝酸鉀作為氮源時,病原菌菌絲的生長速度最快,培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑可以達到89.83 mm,而以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長最慢,菌落平均直徑為9.67 mm。以酵母浸膏作為氮源時,病原菌的產孢量最大,培養(yǎng)7 d后每毫升培養(yǎng)基上產孢量為3.84×105,而以磷酸二氫銨為氮源的每毫升培養(yǎng)基上產孢量最少,為0.57×105。

圖9 不同氮源對XLP1菌絲生長和產孢量的影響Fig.9 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of XLP1注:N1,硝酸鉀;N2,硫酸銨;N3,牛肉提取物;N4,尿素;N5,磷酸二氫銨;N6,酵母提取物;N7,蛋白胨;N8,對照Note:N1,Potassium nitrate;N2,Ammonium sulphate;N3,Beef extract;N4,Urea;N5,Ammonium dihydrogen phosphate;N6,Yeast extract;N7,Peptone;N8,CK

2.5 殺菌劑對細極鏈格孢(A. tenuissima)菌絲生長的影響

由表3可知,5種殺菌劑對引起黑龍江省細綠萍黑腐病的細極鏈格孢株的菌絲生長均表現(xiàn)出抑制作用,但不同藥劑間的抑制作用有所區(qū)別。其中32.5% 苯甲·嘧菌酯的抑制作用最強,EC50值為0.001 2 μg·mL-1;30% 吡唑醚菌酯、30% 唑醚·戊唑醇和30% 噁霉靈次之,EC50值分別為 0.611 5,0.337 1和0.678 0 μg·mL-1;最后是50% 多菌靈,EC50值為4.187 0 μg·mL-1,抑制作用最弱。

表3 5種殺菌劑對鏈格孢菌(XLP1)菌絲生長的抑制效果Table 3 Inhibitive effect of 5 fungicides on mycelial growth of Alternaria tenuissima (XLP1) 單位:μg·mL-1

3 討論

目前,關于細綠萍病害的報道相對較少,在國外已報到的引起滿江紅屬致病菌主要以立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)為主,在印度、伊朗和韓國引起黑腐病、褐斑病和褐腐病。除此之外核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和產黃鐮孢菌(Fusariumthapsinum)也可引起滿江紅屬病害,導致萍產量下降[24-28]。而在國內關于細綠萍病害的研究較少,李鐵成[29]描述了細綠萍腐霉病的發(fā)病癥狀,并提出了防治細綠萍腐霉病的防治建議,但未鑒定病原菌種類及篩選防治殺菌劑。本研究利用形態(tài)學結合分子生物學的方法鑒定出引起細綠萍黑腐病的鏈格孢屬病原真菌細極鏈格孢(A.tenuissima),這也是在國內首次報道。

目前,國內外有較多關于細極鏈格孢侵染而引起植物病害的研究報道,例如:能引起棗[30]和柿子[31]的黑腐病;魔芋(Amorphophallusbulbifer)[32]、刺五加(Acanthopanaxseuticosus)[33]、太子參(Pseudostellariaheterophylla)[34]等多種植物的葉斑病。在不同植物中提取的病原菌,其生物學特性也有所區(qū)別,細極鏈格孢的生長和繁殖受外界多種環(huán)境因素的影響較大,其中最重要的是溫度、pH和碳源、氮源等營養(yǎng)物質。本研究表明引起細綠萍黑腐病的細極鏈格孢菌絲生長最適溫度均為25℃,這與張建強等[35-36]研究結果一致。尚曉靜等[37]認為,細極鏈格孢在15℃時產孢量最高。而本研究中,細極鏈格孢在25℃時產孢量達到最高,表明細綠萍黑腐病病菌孢子耐高溫能力可能有所提升。不同寄主來源的細極鏈格孢菌株具有不同的酸堿適應范圍,尚曉靜等[37]在研究樹莓細極鏈格孢的生物學特性時發(fā)現(xiàn),菌絲最適生長pH值為11.0。趙曉霞等[30]報道贊皇棗細極鏈格孢在pH值10.0時產孢量最大。而在本研究中細綠萍細極鏈格孢的最適菌絲生長和產孢pH值為均為7.0。這表明細綠萍細極鏈格孢具有較寬的適應范圍,能在強酸強堿環(huán)境條件下活躍生長,這與孟婷婷等[36]報道的結果一致。細極鏈格孢可以利用多種碳源、氮源,但在不同寄主上的最適碳源和氮源不同,枸杞細極鏈格孢能較好的利用甘露醇[38],在氮源的選擇上能較好的利用硝酸鉀,這與本研究的結果一致,細極鏈格孢菌絲生長表現(xiàn)為對有機氮和硝態(tài)氮的有效利用更好,而對銨態(tài)氮的利用效率低。而樹莓細極鏈格孢的最適碳源、氮源分別為麥芽糖和半胱氨酸[36],芹菜細極鏈格孢的最適生長碳源為玉米粉[35],與本研究結果不同。造成這種差異的原因可能與病原菌的寄主和地理來源不同有關,且與研究人員所選擇的碳源和氮源不同相關。

目前沒有對細綠萍黑腐病防治的報道,通過我們對細極鏈格孢室內毒力測定結果表明,供試5種殺菌劑均具有較好的抑制效果,其中32.5%苯甲·嘧菌酯抑菌活性最強。袁慧君[39]對梨黑斑病致病菌鏈格孢(A.tenuissima)的研究發(fā)現(xiàn),苯甲·嘧菌酯的抑菌效果最好;楊瑾等[40]在研究常見農藥對丹參莖基腐病病原菌細極鏈格孢抑菌效果時發(fā)現(xiàn),吡唑醚菌酯和戊唑醇的抑制菌絲生長的效果最好。張建強等[41]篩選針對芹菜葉斑病病原菌細極鏈格孢藥劑發(fā)現(xiàn),甲霜靈對細極鏈格孢菌絲和孢子的抑制效果都是最好的。以上結果均與本試驗結果一致。我們建議苯甲·嘧菌酯作為防治細極鏈格孢的首選藥劑,為了防治長期使用單一藥劑導致病原菌產生抗性,其余藥劑可以作為備選交替使用,對該病害的田間化學防治效果需要進行進一步驗證。

4 結論

本文通過采集典型發(fā)病地的病樣進行病原菌的分離并鑒定,確定引起細綠萍黑腐病的病原菌為黑霉科鏈格孢屬的細極鏈格孢(A.tenuissima)。研究結果表明,利于細極鏈格孢菌菌絲生長的條件:全黑暗條件、25℃、培養(yǎng)pH 7.0、丙三醇碳源、硝酸鉀氮源。利于細極鏈格孢菌菌絲產孢的條件:全黑暗條件、25℃、培養(yǎng)基pH 7.0、甘露醇碳源、酵母浸膏氮源。在CMA培養(yǎng)基上細極鏈格孢菌菌絲生長速度較快,在PSA培養(yǎng)基上產孢量最大。細極鏈格孢菌在多種培養(yǎng)基上均可以生長、產孢,可利用多種碳源、氮源,對溫度的適應性較好,能夠適應不同的酸堿環(huán)境。防治細綠萍黑腐病可選用苯甲·嘧菌酯,而吡唑醚菌酯、唑醚·戊唑醇和噁霉靈作為備選藥劑。