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    兔脛骨骨膜下注射轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1和β2促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖的研究

    2012-12-31 13:30:12荊立忠躍林郭秦?zé)?/span>張繼英
    中國微創(chuàng)外科雜志 2012年9期
    關(guān)鍵詞:骨膜脛骨軟骨

    荊立忠 胡 躍林 郭秦?zé)?張繼英

    (北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100191)

    骨膜由纖維層和生發(fā)層兩部分構(gòu)成,生發(fā)層含有大量干細(xì)胞,在特定環(huán)境下可分化為軟骨細(xì)胞。骨膜移植作為修復(fù)軟骨缺損的常見術(shù)式之一已有多年歷史[1,2],其主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、可以整體移植等。但隨著年齡的增長,骨膜生發(fā)層厚度及干細(xì)胞數(shù)量會(huì)逐漸減少[3],是導(dǎo)致骨膜移植修復(fù)軟骨損傷效果不佳的原因之一。促進(jìn)骨膜生發(fā)層干細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)其成軟骨能力,成為移植前要解決的重要問題。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí),轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)β具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等作用。在骨膜移植前通過微量注射器局部注射TGF以促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖具有微創(chuàng)、作用直接等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過比較單次注射TGFβ1或TGFβ2對(duì)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同,初步探討促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖的可行性及規(guī)律,以期提高成年動(dòng)物骨膜生發(fā)層細(xì)胞的成軟骨能力。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

    4月齡的成年新西蘭大白兔22只,(3.0±0.5)kg,雌雄不限(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,許可證編號(hào):SCXK京2011-0008)。

    實(shí)驗(yàn)材料:Hamilton微量注射器(容量10μl,針頭30 gauge)為瑞士Hamilton公司生產(chǎn);TGFβ1與TGFβ2為美國 Peprotech公司生產(chǎn)(catalog:100-21;100-35)。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作 沿兔耳緣靜脈緩慢推注20%烏拉坦全身麻醉,術(shù)前肌注1 ml氯胺酮。以脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)為骨性標(biāo)志,在其內(nèi)側(cè)5 mm處做一5 mm的縱行皮膚切口,勿傷及深層組織,使用微量注射器于脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)內(nèi)側(cè)5 mm注射一針,于第一針以遠(yuǎn)5 mm處注射第二針(圖1)。將大白兔分為3組:①對(duì)照組,于兩位置分別注射10μl Tris溶液(Tris pH=8.0,Sigma公司);②TGFβ1 實(shí)驗(yàn)組:于兩位置分別注射20 ng(10 μl)TGFβ1;③TGFβ2實(shí)驗(yàn)組:于兩位置分別注射20 ng(10μl)TGFβ2。

    圖1 示注射部位

    2個(gè)實(shí)驗(yàn)組各8只兔,對(duì)照組6只,每組兩側(cè)脛骨均納入操作。TGFβ1組:首先對(duì)全部8只兔的左側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作,于第3天對(duì)其中4只右側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作,第5天處死,從而得到3天、5天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本;于第4天對(duì)另外4只右側(cè)脛骨進(jìn)行注射操作,第10天處死,從而得到7天、10天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本。對(duì)照組和TGFβ2組操作與TGFβ1組相同,只是對(duì)照組每次3只。大體觀察后取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標(biāo)本做組織學(xué)切片(每塊標(biāo)本包含2個(gè)注射點(diǎn)),這樣實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)即可獲得8個(gè)觀察數(shù)據(jù),對(duì)照組為6個(gè)。

    1.2.2 大體觀察 術(shù)后第3天、5天、7天、10天將全部兔通過注射過量烏拉坦處死,分離脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜表面深筋膜等軟組織,大體觀察各組注射位置骨膜的增生、腫脹情況。

    1.2.3 標(biāo)本的處理 用骨刀切取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標(biāo)本(包含2個(gè)注射點(diǎn)),面積約10 mm×10 mm,修切整齊,立即浸入4%多聚甲醛固定24小時(shí),生理鹽水沖洗,然后放入10%甲酸脫鈣液脫鈣5~7天,將標(biāo)本切成兩塊(每塊包含1個(gè)注射點(diǎn)),石蠟包埋后切片,厚度5μm。

    1.2.4 組織化學(xué)染色及顯微鏡下觀察 將各組標(biāo)本切片脫蠟,進(jìn)行HE染色。應(yīng)用Image-Pro PLUS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行成像,低倍鏡放大200倍,測(cè)量生發(fā)層厚度(μm)、計(jì)算細(xì)胞密度(×104/cm2);高倍鏡放大400倍,觀察細(xì)胞大體形態(tài)。為保證結(jié)果可靠,測(cè)量3次取平均值。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示,多組之間采用單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行比較,兩兩之間比較采用LSD。P<0.05表示差異有顯著性意義。

    2 結(jié)果

    大體觀察各組注射部位,與外周相比,2個(gè)實(shí)驗(yàn)組5天、7天時(shí)間點(diǎn)的注射部位略顯腫脹,間或見注射器刺激骨膜后形成的微血管網(wǎng)。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組3天、10天及對(duì)照組僅可見微血管網(wǎng),無明顯腫脹。各組骨膜注射部位表面均有光澤。

    低倍鏡下觀察,骨膜分為兩層:淺層纖維層膠原纖維排列緊密,細(xì)胞呈長梭形,細(xì)胞數(shù)量少;深層(即生發(fā)層)細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多。

    各組不同時(shí)點(diǎn)生發(fā)層厚度比較(表1):對(duì)照組注射后各時(shí)點(diǎn)差異無顯著性(P>0.05);TGFβ1組和TGFβ2組注射后第5天生發(fā)層厚度較第3天明顯增加,最大厚度均出現(xiàn)在注射后第7天(P<0.05),注射后第10天與第3天差異無顯著性(P>0.05)。3組間生發(fā)層厚度比較(表 1):注射后第3天、第10天差異無顯著性(P>0.05);注射后第5天、第7天TGFβ1和 TGFβ2組均明顯高于對(duì)照組,且注射后第5天TGFβ2組厚度明顯大于TGFβ1組(P=0.017)。細(xì)胞密度比較(表 1):3組注射后不同時(shí)點(diǎn)以及3組間差異均無顯著性(P>0.05)。

    表1 注射TGFβ1和TGFβ2后不同時(shí)間段生發(fā)層厚度、細(xì)胞密度的比較

    高倍鏡下觀察,對(duì)照組(圖2a)生發(fā)層細(xì)胞核呈橢圓形,藍(lán)色深染,細(xì)胞數(shù)較少。TGFβ1組注射第3天(圖2b)、第10天(圖2e)與對(duì)照組生發(fā)層細(xì)胞形態(tài)類似,第7天(圖2d)骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖顯著,胞核增大呈圓形或橢圓形,藍(lán)色深染,胞漿基質(zhì)豐富,細(xì)胞數(shù)目多。TGFβ2組第3天(圖2 f)、第10天(圖2i)生發(fā)層細(xì)胞形態(tài)與 TGFβ1組第3天(圖2b)、第10天(圖2e)類似,第5天(圖2g)與第7天(圖2h)細(xì)胞形態(tài)與 TGFβ1第7天(圖2d)類似。

    圖2 注射TGFβ后不同時(shí)間點(diǎn)骨膜HE染色 A為空白對(duì)照組(×200);B~E分別為注射TGFβ1后第3天、5天、7天、10天組(×200);F~I(xiàn)分別為注射 TGFβ2后3天、5天、7天、10天組(×200);右上角 a~i分別為放大400倍圖像

    3 討論

    關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及骨關(guān)節(jié)外科研究的難點(diǎn)及重點(diǎn)。利用骨髓、脂肪組織等來源的干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)室研究顯示了較滿意的結(jié)果,但由于需進(jìn)行體外培養(yǎng)、二次手術(shù)與污染風(fēng)險(xiǎn)等因素限制了其在臨床上的應(yīng)用。將骨膜應(yīng)用于各種軟骨缺損的修復(fù)已有多年歷史[1,2]。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可以整體移植,同時(shí)包含干細(xì)胞和各種細(xì)胞因子,無需體外培養(yǎng),從而更加簡單易行。骨膜生發(fā)層干細(xì)胞在一定條件下可以分化為軟骨細(xì)胞,但隨年齡增長,其增殖分化潛能會(huì)逐漸下降[3]。因此,對(duì)于成年患者,其自身骨膜很難在細(xì)胞數(shù)量及密度上達(dá)到移植的標(biāo)準(zhǔn)[4],這就有必要提高骨膜生發(fā)層干細(xì)胞的數(shù)量,從而提高骨膜的軟骨修復(fù)能力。近年大量實(shí)驗(yàn)研究探討了不同細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響,并且證實(shí)TGFβ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化等作用[5,6]。

    本實(shí)驗(yàn)證實(shí),單次注射TGFβ時(shí)細(xì)胞的增殖是短暫的、一過性的。這一結(jié)論與Reinholz等[7]的研究類似。Reinholz等觀察到向成年大白兔脛骨骨膜下單次注射TGFβ1后可以刺激骨膜生發(fā)層細(xì)胞增殖。其最大效應(yīng)出現(xiàn)在注射后第7天,表現(xiàn)為生發(fā)層厚度最大,細(xì)胞數(shù)目最多。不同之處在于本實(shí)驗(yàn)第3天實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比雖略有增加,但并無明顯差異。此外,本研究2個(gè)實(shí)驗(yàn)組注射后10天與對(duì)照組也無明顯差別。這就進(jìn)一步提示干預(yù)后間隔時(shí)間的長短將影響到骨膜生發(fā)層的增殖,時(shí)間過長或過短均達(dá)不到理想的效果。單次注射不同于連續(xù)注射,后者往往可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生成[8,9],但也容易導(dǎo)致骨組織的生成[8],因此并不利于軟骨缺損的修復(fù)。本研究表明,在TGF的干預(yù)下,骨膜生發(fā)層細(xì)胞(包括干細(xì)胞)會(huì)出現(xiàn)一過性增殖。在此時(shí)間段上,如果將TGF誘導(dǎo)的骨膜移植到關(guān)節(jié)內(nèi),保持持續(xù)性的刺激及適宜的微環(huán)境,則可能促進(jìn)骨膜生發(fā)層細(xì)胞進(jìn)一步向軟骨分化。

    不同TGFβ亞型對(duì)不同的細(xì)胞或組織效應(yīng)各異[8]。本實(shí)驗(yàn)比較了骨膜下單次注射 TGFβ1和TGFβ2后對(duì)生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同。結(jié)果顯示單次注射兩者后生發(fā)層細(xì)胞數(shù)量均會(huì)一過性增加,并且TGFβ2對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的增殖效應(yīng)更為明顯。多數(shù)研究是通過幼年動(dòng)物[8,9]或體外[10]進(jìn)行的,結(jié)果雖然也證明兩者可以促進(jìn)生發(fā)層細(xì)胞的增殖和分化,并且TGFβ2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于 TGFβ1,但成年動(dòng)物體內(nèi) TGFβ1和TGFβ2 促生發(fā)層細(xì)胞增殖效應(yīng)的異同尚無研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中TGFβ2的促增殖效應(yīng)之所以相對(duì)較好,原因可能在于 TGFβ2可以誘導(dǎo)合成TGFβ1[8],兩者共同作用于生發(fā)層細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),從而導(dǎo)致更為明顯的增殖效應(yīng)。Pombo-Suarez等[11]觀察到在骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞內(nèi),TGFβ1與TGFβ2的基因表達(dá)存在強(qiáng)烈的相關(guān)性,從而更進(jìn)一步證實(shí)了這種可能性。

    本文的不足之處在于沒有對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的性質(zhì)做鑒定,畢竟生發(fā)層內(nèi)包括成骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞等較多的細(xì)胞成分。因此,注射TGFβ后增殖細(xì)胞的性質(zhì),還有待于通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其細(xì)胞表面標(biāo)志物如 CD90、CD105 等[12,13]進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外,本實(shí)驗(yàn)雖然初步確定了注射TGFβ后生發(fā)層細(xì)胞增殖的時(shí)間窗,觀察到注射后時(shí)間過短或過長增殖效應(yīng)均不明顯,但對(duì)于注射生長因子更長時(shí)間后生發(fā)層細(xì)胞的變化還有待于進(jìn)一步研究。

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