尾葉桉雜種子代DNA提取和SSR引物篩選

李光友，徐建民，吳世軍，杜志鵠，韓 超，王 偉，陸釗華，李寶琦

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

尾葉桉雜種子代DNA提取和SSR引物篩選

李光友，徐建民，吳世軍，杜志鵠，韓 超，王 偉，陸釗華，李寶琦

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

以SSR分子標(biāo)記法分析尾葉桉(Eucalyptus urophylla)及其雜種間關(guān)系，采用改良CTAB法提取總DNA，同時(shí)優(yōu)化提取方法和PCR擴(kuò)增條件。從文獻(xiàn)中選取尾葉桉100對SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的17對引物作為實(shí)驗(yàn)尾葉桉雜種材料的SSR分析引物，為進(jìn)一步對其進(jìn)行遺傳多樣性和有效基因資源利用研究奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)。

尾葉桉家系；DNA提??；SSR引物篩選

桉樹系統(tǒng)引種和栽培在中國已開展20年多年，通過尾葉桉等的引種，在桉樹遺傳改良、資源保存及推廣應(yīng)用上取得重大進(jìn)展[1]。尾葉桉具有速生、適應(yīng)性廣及多種用途的特點(diǎn)，通過引入其它具有速生、耐寒、耐旱、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良桉樹花粉，利用控制授粉技術(shù)獲得更加優(yōu)良的雜種子代。只有通過優(yōu)樹及其雜種子代的基礎(chǔ)研究才會(huì)使尾葉桉雜種人工林獲得更大發(fā)展，滿足社會(huì)對于木材的巨大需求，以期獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。分子水平的研究，使雜種目的性狀的獲得具有不同于表型選擇的穩(wěn)定性和可靠性。

SSR標(biāo)記因具有：整個(gè)基因組中隨機(jī)分布；

多態(tài)性高；重復(fù)性好；技術(shù)難度低；引物序列公開發(fā)表等特點(diǎn)[2]，而在動(dòng)植物的遺傳分析[3-5]中得到了廣泛應(yīng)用，隨后林學(xué)專家開展了該標(biāo)記在林木研究中的利用[6-7]。SSR的共顯性標(biāo)記適用于QTL定位研究，便于對有關(guān)QTL的遺傳動(dòng)態(tài)跟蹤，增強(qiáng)對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力，提高育種中數(shù)量性狀位點(diǎn)判讀的準(zhǔn)確性以加速利用。在育種工作中，SSR技術(shù)與現(xiàn)有育種程序相結(jié)合，為尾葉桉的分子輔助選擇和遺傳改良提供了科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)目的基因的定位和選擇、為其有效利用提供技術(shù)和材料保證，從而加快育種進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用尾葉桉家系來自課題早期引種種子園。具體參試種源及家系來源見表1。不同家系隨機(jī)取樣，不同個(gè)體分別登記，共151株。每株取其幼嫩葉片，擦拭干凈低溫保存。注入與未注入家系間關(guān)系及研究方法參見文獻(xiàn)[8]。

表1 參試桉樹種批原產(chǎn)地及家系編號(hào)Table 1 Seeds sources of seed-lots and numbers of families used in the trial

PCR過程中用于實(shí)驗(yàn)篩選的100引物引自文獻(xiàn)[9]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，同時(shí)實(shí)驗(yàn)用Taq酶、dNTPs、Loading buffer及 Maker等均購自該公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和濃度確定[10-11]

采用改進(jìn)CTAB法提取的桉樹進(jìn)行DNA提取。取適量葉碎樣于2 mL磨樣管中，加入鋼珠；在球磨儀上磨3.5 min，24次/秒，P1模式；加入1 mL CTAB液(含2%B-巰基乙醇)，65 ℃水浴45 min，需數(shù)分鐘1次震蕩；離心10 min，12 000 r·min-1；取上清于1 mL新管中，200 μL槍頭，然后各管中加入等體積氯仿-異戊醇液(24∶1, v/v)；離心10 min，取上清于新管中，加入550 μL氯仿-異戊醇液；離心10分鐘，再取上清于新管中，加入4 ℃異丙醇約400 μL沉淀；－20 ℃冰箱冰凍10 h以上；取出解凍，離心10 min，倒上清，吸干；加入75%酒精1 mL洗滌洗3次，然后吸干；重復(fù)本步驟；45 ℃下干燥機(jī)內(nèi)干燥5 min；加入1×TE150 μL，離心10 min，將上清移至新管中，管中液體即為含有DNA的樣品；

提取后對DNA濃度檢測。每樣品取2 μL加4 μL Loading buffer，移液槍混勻后用1%瓊脂糖凝膠電泳。以100 bp plus的DNA Ladder標(biāo)定，初步判定2 μL樣中所含DNA量，然后根據(jù)檢測濃度將提取各DNA樣稀釋成相同的實(shí)驗(yàn)濃度，供PCR擴(kuò)增時(shí)采用。

1.2.2 引物篩選[12]具體步驟：

(1) 以2個(gè)母本DNA進(jìn)行條件優(yōu)化(采用第6對引物來進(jìn)行，98 bp)進(jìn)行32次初篩；(2) 在初篩獲得的優(yōu)化條件，以該2母本及其子代進(jìn)行復(fù)篩，各進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇擴(kuò)增效果好的引物。最終從尾葉桉100對SSR引物中篩選出適合本批次樣品的17對引物用于全部樣品擴(kuò)增和SSR分析(見表2)。

表2 尾葉桉SSR分子標(biāo)記用引物序列及退火溫度Table 2 The primer sequence and annealing temperature for SSR of Eucalyptus urophylla

1.2.3 PCR擴(kuò) 增PCR擴(kuò) 增 反 應(yīng) 在AB 2720 Thermal Cycler上完成。

對Mg2+、Taq酶、dNTPs及模板濃度條件的多次優(yōu)化和篩選，同時(shí)每次PCR做一個(gè)負(fù)對照來檢測試劑是否污染。反應(yīng)在滅菌的0.2 mL薄壁離心管中和PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系采用10 μL反應(yīng)體系，即10 × buf fer1.0 μL、25 mM MgCl20.6 μL、l0 mM dNTPs 0.30 μL、Primer 0.4 μL、5UTaq DNA聚合酶0.1 μL和2.0 μL DNA模板4 ng，最終加ddH2O至Total10 μL。樣品94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃條件下保存擴(kuò)增樣品。反應(yīng)步驟：

1)tt冰浴中每反應(yīng)管中加人2.0 u1DNA模板；

2)按以上建立反應(yīng)體系取反應(yīng)物依次裝入1滅菌1.5 mL離心管中，渦旋2～3 s；

3)取上述混合物10.0 μL，分別加人0.2 mL反應(yīng)管中，使每管的總反應(yīng)體積為10.0 μL；

4)將裝有反應(yīng)液的離心管在臺(tái)式渦旋機(jī)上渦旋 2～3 s；

5)混勻好的離心管放人臺(tái)式離心機(jī)內(nèi)離心5～6 s，取出后離心管蓋蓋；

6)離心管置于PCR儀上擴(kuò)增，結(jié)束后，樣品管4 ℃冰箱保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR結(jié)果檢測。

1)配制足夠量的電泳緩沖液(0.5×TBE)，倒入電泳槽中備用；現(xiàn)配1.2%的瓊脂糖凝膠；

2)凝膠稍涼后加入鼎國生物GoldviewTM牌Nucleic Acid Stain染料(5 μL/100 mL)，輕輕搖勻；

3)將制膠模具置于水平板上，調(diào)水平，兩端用封口膠封住；

4)常溫下置膠于60 ℃時(shí)，倒入模具內(nèi)，約3～5 mm厚，然后迅速在模具一端安插上梳子；

5)室溫冷卻待瓊脂糖凝膠全部凝固，輕拔出梳子，并移去擋板；

6) 用移液槍混勻樣品，點(diǎn)樣品于凝膠孔內(nèi)(每孔含擴(kuò)增樣2 μL和4 μL溴酚藍(lán))，樣品按順序點(diǎn)入，同時(shí)點(diǎn)入北京鼎國生產(chǎn)的DGL 2000 DNA Marker(100～2000 bP )用于比對；

7)將有樣品的一端置于電泳槽負(fù)極端，電泳液沒過瓊脂糖凝膠l mm左右，電泳電壓為105 V；

8)電泳結(jié)束后，將凝膠平鋪在凝膠成像儀內(nèi)，打開紫外燈，檢測擴(kuò)增結(jié)果并記錄。

1.2.5 銀染法檢測擴(kuò)增結(jié)果的程序

1)對瓊脂糖凝膠電泳檢測能獲得引物專一和擴(kuò)增清晰的樣品，進(jìn)行銀染法檢測；

2)PAGE膠的制備

玻璃板的清洗。用水洗凈，垂直晾干；水平放置玻璃板+無水乙醇擦1次；凹板玻璃用剝離硅烷清洗、紙巾涂勻，4～5 min后95%乙醇擦2～3次；平板玻璃以2.0 mL乙醇+50 μL親合硅烷涂勻，3～5 min后紙吸去多余親合硅烷。后組裝玻璃面加上側(cè)邊密封條并灌膠；

灌膠。90 mL6%的變性聚丙烯酰胺中加入TEMED30 μL、10%過硫酸銨(0.1 g溶于水，現(xiàn)配)800 μL，在平穩(wěn)玻璃面上勻速傾倒膠，同時(shí)扶住凹板玻璃往上扣下，勻速無泡且防膠漏，待膠流動(dòng)均勻布滿玻璃面后，夾好兩塊吻合玻璃，在灌膠口倒插入梳子，聚合5 min至膠凝固，后取出梳子，再正向插入梳齒，形成各樣孔間密封的點(diǎn)樣孔；

3)電泳

灌裝1×TBE電泳液于上下槽中，豎膠版于電泳槽內(nèi)。70 W恒功率預(yù)電泳15 min。斷電條件下點(diǎn)樣，點(diǎn)樣時(shí)的Maker為Bio BASIC Inc.生產(chǎn)的 GM345 DNA Marker (50～1000 bP 1adder-H2)。

每樣孔加6 μL預(yù)變性的PCR擴(kuò)增混合樣品(擴(kuò)增產(chǎn)物與指示劑按10：3，指示劑為甲酰胺+溴酚蘭)，70 W恒功率電泳90 min(50～300 bp擴(kuò)增產(chǎn)物)，電泳結(jié)束后，用刀片分開兩塊玻璃板，膠會(huì)緊貼在涂有binding Silane 的平板玻璃上。

4)銀染

過程：銀染(膠板置入染色液中，輕輕搖動(dòng)并淹沒板面10～15 min)-沖洗(用2 000 ml去離子水沖洗膠板3～5 min)-顯影(膠板快速轉(zhuǎn)移到1 600 mL顯影液中并輕輕搖動(dòng)，直到譜帶出現(xiàn))-沖洗(用去離子水或自來水沖洗3～4 min，洗掉其上的堿性物質(zhì))-干燥：室溫下晾干，長期保存。

5)判讀，分析

采用上海小源科技有限公司小源凝膠圖像分析系統(tǒng)對所拍圖片判讀或?qū)︺y染片直接判讀統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用POPGENE Version 1.32[13]軟件進(jìn)行不同家系/個(gè)體間相互關(guān)系的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的優(yōu)化

DNA質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。為了得到高質(zhì)量的基因組DNA，試驗(yàn)中對常規(guī)CTAB法進(jìn)行改良,增加了2%β-巰基乙醇和DNA材料多次異丙醇沉淀離心、乙醇洗浴和TE溶液溶解的步驟洗去雜質(zhì)，獲得了較高質(zhì)量和濃度的DNA (圖1)，從而滿足實(shí)驗(yàn)所需。

圖1 兩批次各30個(gè)個(gè)體DNA濃度檢測(M-100bp plus DNA ladder， Lane1-30：樣本DNA)Fig. 1 The total DNA was extracted from 30 samples of Eucalyptus urophylla

從圖1看出，第1批30個(gè)樣中，除16號(hào)濃度稍低外，其它樣品DNA幾乎均高于標(biāo)準(zhǔn)DNA(M)；第2批樣品中16、22號(hào)DNA濃度低于標(biāo)準(zhǔn)濃度。2批次結(jié)果表明16號(hào)樣品需要重新提取DNA。

2.2 擴(kuò)增條件的優(yōu)化

通過正交設(shè)計(jì)和重復(fù)試驗(yàn)，在反應(yīng)體系中以不同濃度的MgCl2、dNTP、模板DNA配比，并以文獻(xiàn)給定46～64 ℃的退火溫度處理，研究不同因素組合對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明在退火溫度給定的情況下擴(kuò)增關(guān)鍵在于Taq酶濃度、引物濃度以及Mg2+濃度，這與王潤輝等[14]對松樹雜種SSR反應(yīng)條件的優(yōu)化所得結(jié)論一致。

2.3 SSR引物的篩選

，獲得本次實(shí)驗(yàn)所需的SSR引物。盡管在PCR過程省去對退火溫度的優(yōu)化，但并非所有現(xiàn)成引物均能擴(kuò)增產(chǎn)物和產(chǎn)生清晰條帶。另外參試家系通過人工雜交，其子代親緣關(guān)系較近，因此具有不同于相同引物對天然群體的擴(kuò)增效果。因此本研究利用尾葉桉的SSR標(biāo)記，從100對引物中篩選合適的引物，進(jìn)行擴(kuò)增，在淘汰了無擴(kuò)增帶和擴(kuò)增后多態(tài)性不理想的引物，選留那些擴(kuò)增條帶清晰而且有明顯多態(tài)性片段的引物。最終獲得適用于尾葉桉雜種子代研究的17對引物(表2)。

2.4 同一引物不同樣品的擴(kuò)增效果

對尾葉桉進(jìn)行了17對引物的擴(kuò)增和效果檢驗(yàn)，其中3對引物的結(jié)果見圖2。

圖2 3對SSR引物在尾葉桉不同個(gè)體中擴(kuò)增出的多態(tài)圖譜Fig. 2 SSR polymorphism in E. urophylla hybrids with EMBRA23, EMBRA44 and EMBRA59

圖2為3對SSR引物對部分尾葉桉雜種個(gè)體的PCR擴(kuò)增后經(jīng)PAGE膠電泳后的多態(tài)圖譜，不同個(gè)體間擴(kuò)增出差異性條帶，個(gè)體間表現(xiàn)出差異和等位基因的分離，多態(tài)性明顯。

3 討 論

在現(xiàn)實(shí)遺傳標(biāo)記技術(shù)中，通過建立、篩選基因組文庫，克隆測序、引物設(shè)計(jì)等一系列實(shí)驗(yàn)，獲得可靠且用于生產(chǎn)實(shí)踐的SSR分子標(biāo)記，需要投入大量人力、物力。隨著參與人員和研究方法的增多、互聯(lián)網(wǎng)資源共享，使更有效、更深入的技術(shù)研究獲得成效，實(shí)用性和目的性更強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)著微觀指導(dǎo)宏觀的現(xiàn)實(shí)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)利用已有文獻(xiàn)中的尾葉桉SSR引物中篩選出適合尾葉桉人工雜種使用的17對引物，實(shí)現(xiàn)多態(tài)性和穩(wěn)定性擴(kuò)增，達(dá)到對近親群體的進(jìn)一步研究和利用。從擴(kuò)增圖譜上看，引物對部分家系材料進(jìn)行了擴(kuò)增，每個(gè)樣品基本上都獲得清晰的擴(kuò)增條帶，多態(tài)位點(diǎn)較多。實(shí)驗(yàn)過程中所選的材料包括了尾葉桉自由或控制授粉全同胞或半同胞家系，具有一定的代表性，建立的尾葉桉人工雜種子代SSR擴(kuò)增體系，為進(jìn)一步研究親緣關(guān)系較近群體的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。目前國內(nèi)對尾葉桉遺傳多樣性、從DNA水平揭示尾葉桉遺傳資源方面的研究文獻(xiàn)[15-16]較少。國外為保障育種項(xiàng)目的長期遺傳增益而進(jìn)行了尾葉桉育種群體遺傳多樣性研究[17-18]。今后為保障桉樹育種工作的有效和持續(xù)進(jìn)行，需要利用分子標(biāo)記對天然雜交種的鑒定，繁育系統(tǒng)的研究，和目的基因定位。本研究也為尾葉桉人工雜種研究提供了SSR分子標(biāo)記引物。隨著對尾葉桉雜種進(jìn)一步開發(fā)利用和研究，SSR分子標(biāo)記將應(yīng)用于尾葉桉雜種子代優(yōu)良無性系品種鑒定、遺傳分析、遺傳圖譜建立、分類研究、目的基因應(yīng)用以及種質(zhì)資源鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。

利用文獻(xiàn)獲得100對尾葉桉SSR分析的引物中，僅17對引物產(chǎn)生較好擴(kuò)增效果和多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物，可能與入選的人工控制授粉家系各個(gè)體間親緣關(guān)系較近有關(guān)，今后需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 白嘉雨.桉樹遺傳育種的回顧及發(fā)展前景[J].廣西林業(yè)科學(xué),35(4):221-226.

[2] 王紅梅,張正英,陳玉梁.SSR標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳學(xué)中的應(yīng)用[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào),2003,39(1):113-116.

[3] Dib C. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites [J].Nature, 1996, 380:152-154.

[4] Taramino G. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize[J].Genome, 1996,39: 277-287.

[5] Guiford P, Prakash S, Zhu J M, et al. Microsatellites in Malusхdomestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification[J].Theor Appl Genet, 1997,94: 249-254.

[6] 徐立安,李新軍,潘惠新,等.用SSR研究栲樹群體遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 植物學(xué)報(bào),2001,43(4):409-412.

[7] 鄭 健,鄭勇奇,張川紅,等.花楸樹天然群體的遺傳多樣性研究[J].生物多樣性,2008,16(6):562-569.

[8] 李光友,徐建民,白嘉雨,等.離子注入對桉樹萌發(fā)及苗期生長的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(5):44-48.

[9] Brondani R P V, Williams E R, Brondani C,et al. A microsatellitebased consensus linkage map for species of Eucalyptus and a novel set of 230 microsatellite markers for the genus[J]. BMC Plant Biology, 2006, 6:20doi:10.1186/1471-2229-6-20.

[10] 郭 勇.利用EST-CAPS標(biāo)記構(gòu)建桉樹遺傳圖譜[D].中國林科院碩士論文,2008.

[11] 李志輝,龐 統(tǒng),楊模華.桉屬植物葉片DNA抽提[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2005,21(2):5-7.

[12] 王艷敏,魏志剛,楊傳平.白樺EST-SSR信息分析與標(biāo)記的開發(fā)[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(2):78-84.

[13] Yeh F C, Yang R C, Boyle T POPGENE. The User-Friendly Shareware for Population Genetic Analysis[M]. Molecular Biology and Biotechnology Centre, Universityof Alberta,Edomonton, Canada,1997.

[14] 王潤輝,趙奮成.濕地松、加勒比松及其雜交種DNA的提取與微衛(wèi)星PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].廣東林業(yè)科技,2006,22(1):1-4.

[15] 甘四明,施季森,白嘉雨,等. RAPD標(biāo)記在桉屬種間雜交一代的分離方式研究,林業(yè)科學(xué)研究, 2001,14(2):125-130.

[16] 甘四明,白嘉雨,吳坤明,等.7個(gè)桉樹雜交親本RAPD位點(diǎn)多態(tài)性和雜合性的研究[J].林業(yè)科學(xué), 2003,39(2):162-167.

[17] Gaioto F A, Bramucci M, Grattapaglia D. Estimation of outcrossing rate in a breeding population of Eucalyptus urophylla using dominant RAPD and AFLP markers [J].Theor. Appl Genet.,1997,95:842-849.

[18] Leite S M, Bonine C A, Mori E S, et al.Genetic variability in a breeding population of Eucalyptus urophylla[J].Silvae Genet,2002,51: 5-6.

DNA extracting and SSR primer screening of Eucalyptus hybrids

LI Guang-you, XU Jian-min, WU Shi-jun, DU Zhi-hu, HAN Chao, WANG Wei, LU Zhao-hua, LI Bao-qi
(Research Institute of Tropical Forestry, CAF, Guangzhou 510520,Guangdong,China)

The total DNA of Eucalyptus urophylla and the hybrids were analyzed using SSR markers. The total DNA was eхtracted by means of improved CTAB isolation method, the eхtraction methods and PCR amplification conditions were optimized. 17 primers were screened from 100 primers which were from a published-article eхisting in Eucalyptus urophylla, which had high polymorphism and stability. The results provide references for genetic diversity research of Eucalyptus urophylla families and single tree using SSR marker.

Eucalyptus urophylla; DNA eхtraction; SSR primer screening

S792.39

A

1673-923X(2012)02-0081-05

2011-09-15

十二五“高產(chǎn)抗逆桉樹”新品種的選育研究（2012BAD01B04-1）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2009KJCX004-02）；廣東省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化（2009-BS01）；國家科技成果推廣項(xiàng)目“桉樹速生豐產(chǎn)地力維持與可持續(xù)經(jīng)營技術(shù)推廣示范”；國家公益行業(yè)專項(xiàng)（201104003）

李光友(1970—)，男，重慶開縣人，副研究員，博士，主要從事熱帶林木遺傳育種研究；E-mail: rwater3000@sohu.com

[本文編校：文鳳鳴]