復(fù)合氨基酸螯合鈣的合成工藝優(yōu)化

馬海霞 楊賢慶 胡振珠

張 楨1 陳勝軍1 楊 燕1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

復(fù)合氨基酸螯合鈣的合成工藝優(yōu)化

馬海霞1，2楊賢慶1，2胡振珠1

張 楨1陳勝軍1楊 燕1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

以魚類加工下腳料魚頭、魚排為原料制備復(fù)合氨基酸螯合鈣，采用Plackett－Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)法對螯合工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，pH值和氨基態(tài)氮對螯合率有顯著影響（P＜0.05），復(fù)合氨基酸液中氨基酸的種類及其含量對螯合效果影響較大，當(dāng)氨基酸濃度大于2.1mg／mL時(shí)，螯合鈣中相應(yīng)的氨基酸相對含量也較高；在復(fù)合氨基酸液與鈣液螯合時(shí)，甲硫氨酸和甘氨酸對鈣的螯合能力均大于丙氨酸。優(yōu)化后的螯合工藝參數(shù)：pH值7.90，溫度50℃，時(shí)間60min，氨基態(tài)氮濃度為3.66g／L，復(fù)合氨基酸液∶鈣液（V∶V）20∶1，該條件下螯合率為58.19%。

Plackett－Burman設(shè)計(jì)；復(fù)合氨基酸螯合鈣；甲硫氨酸；甘氨酸；螯合

氨基酸螯合鈣是一類金屬螯合物，與磷酸鈣、碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、醋酸鈣、乳酸鈣等相比，易于被人體吸收、副作用小、生物利用率高，而且在補(bǔ)鈣的同時(shí)又可補(bǔ)充人體必需的氨基酸，是一種較理想的補(bǔ)鈣產(chǎn)品［1－3］。羅非魚、斑點(diǎn)叉尾鮰等魚類加工下腳料占到魚體重量的50%以上，如中國凍羅非魚片2009年產(chǎn)量超過22萬t，僅產(chǎn)生的魚頭、魚排下腳料就超過14萬t，約占魚體重量的36%～40%［4］；這些下腳料多作為飼料原料被廉價(jià)銷售，附加值很低。魚骨中除含有蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)元素以外，還含有大量的鈣、鐵、鋅、鎂、磷及膠原成分，是開發(fā)骨源補(bǔ)鈣產(chǎn)品的良好資源。

國內(nèi)關(guān)于氨基酸螯合鈣合成工藝的文獻(xiàn)報(bào)道很多，主要表現(xiàn)在兩方面：① 由單一氨基酸與某一鈣鹽反應(yīng)的制備工藝［5－7］；② 復(fù)合氨基酸螯合鈣的制備工藝［1，8－12］，其復(fù)合氨基酸和鈣源分別是雞羽毛水解物和文蛤殼、米渣蛋白水解物和Ca（OH）2、豆粕水解物和動物骨骼或骨渣（生產(chǎn)骨膠的廢棄物）、低值魚蛋白酶解物和CaCl2等。而以魚類加工廢棄物魚頭、魚排酶解物為復(fù)合氨基酸來源、魚骨為鈣源開發(fā)復(fù)合氨基酸螯合鈣產(chǎn)品迄今較少見報(bào)道。本試驗(yàn)以羅非魚加工下腳料魚頭、魚排為原料，采用Plackett－Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化出最適螯合工藝條件，并對比、分析酶解液和螯合鈣產(chǎn)品中的氨基酸組成及其含量，以期為魚類加工下腳料的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚頭、魚排：廣州市恒發(fā)水產(chǎn)有限公司；

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為（999±2）mg／L，德國 Merck公司；

胰蛋白酶：酶比活力1×105U／g，廣州齊云生物科技有限公司；

風(fēng)味蛋白酶：酶比活力8×104U／g，廣州華琪生物有限公司；

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國sigma公司；

其它試劑：均為分析純；

試驗(yàn)所有用水：均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)：TD5A－WS，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

pH 計(jì)：PB－10，德國Sartorius集團(tuán)；

恒溫水浴鍋：DK－S 24型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9145型，上海恒科技術(shù)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELA N－1000，托普儀器有限公司；

紫外／可見分光光度計(jì)：Spectronic GENESYS 5，美國Thermo公司；

智能電位滴定儀：809Titrando，瑞士萬通中國有限公司；

原子吸收分光光度計(jì)：AA240FS，美國Varian公司；

微波消解器：MARS5，美國CEM公司；

氨基酸自動分析儀：日立835－50型，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合氨基酸螯合鈣制備工藝流程

1.3.2 復(fù)合氨基酸液制備 取一定質(zhì)量魚頭、魚排，剁碎，按以下條件酶解：固液比3∶1（m∶V），pH 6.5，酶濃度1.5%，復(fù)合酶比例（風(fēng)味蛋白酶∶胰蛋白酶）1∶3，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4h。酶解結(jié)束后，將酶解液溫度升至90℃并保持20min滅酶，冷卻，過濾，濾液貯藏于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Plackett－Burman設(shè)計(jì) 影響螯合率的可能因素有pH值、反應(yīng)溫度、氨基態(tài)氮濃度、時(shí)間、復(fù)合氨基酸液∶鈣液（體積比）等［13，14］，對這5個(gè)因素進(jìn)行考察，選用N＝6的Plackett－Burman設(shè)計(jì)，并設(shè)1個(gè)空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素取高（＋1）低（－1）兩個(gè)水平，以螯合率作為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab 15軟件分析計(jì)算各因素的效應(yīng)值，并對各因素效應(yīng)進(jìn)行t檢驗(yàn)，選擇顯著因素進(jìn)一步試驗(yàn)。各因素所代表的參數(shù)、水平見表1。

表1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)的因子水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman design

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由Plackett－Burman法篩選出的顯著因子是pH值（X1）和氨基態(tài)氮濃度 （X4），pH值的最小值和最大值分別取6.25、8.50，氨基態(tài)氮濃度的最小值和最大值分別取2.0、3.8，pH值、氨基態(tài)氮濃度的步長分別取0.25、0.2，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH值、氨基態(tài)氮濃度分別為8.25、3.60作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)的因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)的因子水平表Table 2 Factors and levels of response surface central composite design

1.3.5 鈣的測定 采用微波消解－火焰原子吸收分光光度法測定。

（1）樣品前處理：稱取樣品約0.500g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10mL，在微波消解儀中消解（功率800W，比例100%，升溫時(shí)間15min，消解溫度180℃，保持時(shí)間20min）。消解結(jié)束后，取出消解罐，冷卻，將消解液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯溶樣杯中，在電熱板上于180℃趕酸直至消解液為無色透明，冷卻，然后將其轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中用20g／L氧化鑭定容至刻度，待測定。

（2）儀器操作參數(shù)：波長422.7nm，夾縫0.5nm，空氣流量13.5L／min，乙炔流量2.00L／min，燈電流10.0mA。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定 游離氨基酸樣品制備：稱取約0.100 0g樣品，加入5%磺基水楊酸10mL浸提24h，離心（15 000r／min，4℃，15min），收集上清液；重復(fù)以上步驟兩次，合并上清液，移入50mL容量瓶中，用水定容，待上機(jī)分析。儀器測定條件：離子交換柱，2.6mm×150mm；交換樹 脂 型 號，NO.2619（52051）；柱 溫，53 ℃；泵 流 速：0.225mL／min；泵壓力：90kg／cm2；洗脫液：IPH－1，2，3，4；分析時(shí)間：72min；進(jìn)樣體積：50μL。

1.3.7 螯合率計(jì)算 螯合率按式（1）計(jì)算：

式中：

c—— 螯合率，%；

m1——鰲合態(tài)鈣元素含量，g；

m2——反應(yīng)體系中鈣元素含量，g。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Minitab 15軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3、4。由表4可知，對螯合率有顯著影響（P＜0.05）的因子是pH值和氨基態(tài)氮濃度，二者對螯合率均有正效應(yīng)，要提高螯合率可以適當(dāng)提高pH值和氨基態(tài)氮濃度。其它因素影響不顯著，可以維持在較低水平。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能較好地反映真實(shí)情形，所以，要先逼近最大螯合區(qū)域后才能建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett－Burman法篩選出的顯著因子效應(yīng)大小設(shè)定它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找最大螯合區(qū)。

表3 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design of Plackett－Burman and corresponding rusults

由表4可知，pH值和氨基態(tài)氮濃度為顯著影響因子，因此選擇這兩個(gè)因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。由于pH值對螯合效果的影響較大，選pH值作為標(biāo)準(zhǔn)，按照pH遞增，氨基態(tài)氮濃度相應(yīng)遞增設(shè)計(jì)試驗(yàn)，pH值、氨基態(tài)氮濃度的步長依次取0.25、0.2。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。由表5可知，最大螯合率出現(xiàn)在第9次試驗(yàn)附近，故以試驗(yàn)9的條件作為中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表4 Plackett－Burman試驗(yàn)參數(shù)估計(jì)表 Table 4 Parameter estimation of Plackett－Burman design

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

以螯合效果最好的區(qū)域進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，2因素5水平的響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

2.3.1 回歸模型的建立及置信度分析 由Minitab 15軟件擬合的方程：

回歸模型系數(shù)的估計(jì)見表7，方差分析見表8。由表7、8可知，交互項(xiàng)的系數(shù)和均方差較小，說明響應(yīng)面分析所選的2個(gè)因素之間交互效應(yīng)較小。在α＝0.01水平上，該模型失擬不顯著，回歸高度顯著。決定系數(shù)R2＝97.89%，表明97.89%的變化可由此模型解釋，因此可以用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對復(fù)合氨基酸螯合鈣的螯合率進(jìn)行分析和預(yù)測。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Central composite design and corresponding results

表7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)估計(jì)表Table 7 Parameter estimation of central composite design

表8 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表 Table 8 Analysis of variance for central composite design

2.3.2 顯著因素水平的優(yōu)化 運(yùn)用Minitab 15軟件對回歸方程進(jìn)行分析，結(jié)合圖1、2三維響應(yīng)面圖和等高線圖可求出的該方程的最大值及對應(yīng)的因素水平X1＝ －1.414，X4＝0.271 4，即pH 值為7.896 5，氨基態(tài)氮濃度為3.654 3g／L?？紤]到實(shí)際的操作，pH取7.90，氨基態(tài)氮濃度為3.66g／L。優(yōu)化后的螯合工藝參數(shù)：pH 值7.90，溫度50℃，時(shí)間60min，氨基態(tài)氮濃度為3.66g／L，復(fù)合氨基酸液∶鈣液為20∶1（V∶V），此時(shí)的理論最大螯合率為62.04%。而實(shí)際螯合率為58.19%，說明實(shí)際產(chǎn)量與預(yù)測值比較接近，模型能很好的預(yù)測螯合情況。

圖1 pH值和氨基態(tài)氮濃度對螯合率的響應(yīng)圖Figure 1 Surface plot for the effects of pH vs.amino nitrogen concentration on chelating rate

圖2 pH值和氨基態(tài)氮濃度對螯合率的等高線圖Figure 2 Contour plots for the effects of pH vs.amino nitrogen concentration on chelating rate

2.4 復(fù)合氨基酸液與螯合鈣產(chǎn)品中的氨基酸組成對比分析

由表9可知，復(fù)合氨基酸液中含量最多的6種氨基酸依次是亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸（含量均大于2.4mg／mL），它們之和占到氨基酸總量的61.45%；對應(yīng)螯合鈣中含量最多的氨基酸也依次是這6種，它們占到螯合鈣氨基酸總量的62.43%。此外，在復(fù)合氨基酸液中含量小于2.0mg／mL的丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸分別占氨基酸總量的百分比為5.07%、4.62%、2.66%，但在螯合鈣中三者占氨基酸總量的百分含量則分別為4.02%、5.15%、4.21%，這說明復(fù)合氨基酸液與鈣液螯合時(shí)，甲硫氨酸和甘氨酸對鈣的螯合能力均大于丙氨酸。

表9 復(fù)合氨基酸液與螯合鈣中的氨基酸種類和含量Table 9 Variety and content of amino acid in compound amino acid solution and chelated compound amino acid calcium

3 結(jié)論

（1）優(yōu)化后的螯合工藝參數(shù)：pH值7.90，溫度50℃，時(shí)間60min，氨基態(tài)氮濃度為3.66g／L，復(fù)合氨基酸液∶鈣液為20∶1（V∶V）。在此條件下理論螯合率為62.04%，而實(shí)際螯合率為58.19%，說明實(shí)際產(chǎn)量與預(yù)測值比較接近，模型能很好的預(yù)測螯合情況。

（2）復(fù)合氨基酸液中的氨基酸種類及其含量對螯合效果影響較大，當(dāng)氨基酸含量大于2.1mg／mL時(shí)，螯合鈣中對應(yīng)的氨基酸相對含量也較高；復(fù)合氨基酸液中含量小于2.0mg／mL的丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸，在復(fù)合氨基酸液與鈣液螯合時(shí)，前兩者對鈣的螯合能力均大于丙氨酸。

（3）所制得的復(fù)合氨基酸螯合鈣產(chǎn)品為粉末狀，色澤淡黃，具特有的鮮味，暴露于空氣中易吸潮變粘，鈣含量為26.14mg／g，溶解度為78.42g／100g，水溶液 pH 值 為6.23±0.05。

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Optimization of synthetization process for chelated compound amino acid calcium

MA Hai－xia1，2YANG Xian－qing1，2HU Zhen－zhu1

ZHANG Zhen1CHEN Sheng－jun1YANG Yan1

（1.South China Sea Fisheries Research Institute，CAFS，Guangzhou，Guangdong510300，China；2.National R＆D Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou，Guangdong510300，China）

The chelating condition of chelated compound amino acid calcium from fish heads and fish ribs was optimized using Plackett－Burman design，steepest ascent design and central composite design.The experiments results indicated that pH value and the concentration of amino nitrogen significantly affected the chelating rate（P＜0.05）.The variety and content of amino acid in compound amino acid solution also had influence to the chelating rate，the amino acid content in the chelated calcium was higher when the amino acid concentration was more than 2.1mg／mL，and calcium was easier to be chelated by methionine and glycine than alanine.The optimal chela－ting condition for maximum chelating rate was：pH value 7.9，temperature 50℃，chelating time 60min，concentration of amino nitrogen 3.66g／L，volume ratio（volume of compound amino acid solution：volume of calcium solution）20∶1，and the highest chelating rate was 58.19%.

Plackett－Burman design；chelated compound amino acid calcium；methionine；glycine；chelate

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.057

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號：CARS－49）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（編號：2010GB23260577；2010GB2E000335）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2009A020700004）；廣東省水產(chǎn)蛋白改性技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（編號：2011A020102005）

馬海霞（1977－），女，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院助理研究員，碩士。E－mail：haixiam＠gmail.com

楊賢慶

2011－11－10