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    環(huán)氧合酶-2抑制劑聯(lián)合苦參堿逆轉(zhuǎn)K562/AO2細胞多藥耐藥的研究

    2012-12-25 07:38:24桂琳李靜陳寶安高峰王筠蔡曉輝
    關(guān)鍵詞:塞來苦參堿條帶

    桂琳,李靜,陳寶安,高峰,王筠,蔡曉輝

    (1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蚌埠第三人民醫(yī)院血液科,安徽蚌埠 233000;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院血液科,江蘇南京 210009)

    白血病的多藥耐藥是導(dǎo)致臨床上白血病化療失敗的主要原因之一,已經(jīng)證實人P-糖蛋白(P-gp)的過表達與腫瘤的多藥耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。最近已有報道顯示,環(huán)氧合酶-2(COX-2)和腫瘤細胞的多藥耐藥基因(multidrug resistance associated protein,MRP)1表達可增加MDR1基因產(chǎn)物P-gp的表達[1]。COX-2是前列腺素合成過程中的一個主要限速酶,在多種上皮來源的腫瘤組織中高表達,而在正常組織中幾乎不表達。有研究表明,COX-2過表達與實體瘤多藥耐藥密切相關(guān),是實體瘤多藥耐藥重要的促進因素,但其確切的機制尚不清楚[2-3]。本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞術(shù)、RT-PCR和Western blotting方法檢測COX-2抑制劑塞來昔布、苦參堿單獨及聯(lián)合應(yīng)用對細胞凋亡,MDR1、P-gp等表達變化的影響,探索COX-2與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司,青霉素和鏈霉素均為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品,塞來昔布為南京德寶生化器材有限公司提供,苦參堿注射液由遼寧玉皇藥業(yè)有限公司提供,阿霉素(ADM)為浙江海正藥業(yè)產(chǎn)品,MTT由美國Sigma公司提供,Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒是進口分裝產(chǎn)品(原晶美產(chǎn)品),RT-PCR試劑盒是Fermentas公司產(chǎn)品,COX-2單抗和P-gp單抗均為Abcam產(chǎn)品,COX-2基因、MDR1和GAPDH等引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(序列查自PubMed)。COX-2上游為TCTGAAACCCACTCCAAACAC,下游為 GCCCTCGCTTATGATCTGTC。MDR1上游為TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG,下游為 AGATCAG CAGGAAAGCAGCACCTA。GAPDH(614 bp)上游為GCCACATCGCTCAGACAC,下游為CATCACGCCACAG TTTCC。

    1.2 細胞與細胞培養(yǎng)

    人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞敏感株K562由本實驗室長期保存,耐藥細胞株K562/AO2細胞是經(jīng)ADM逐步誘導(dǎo)、具有多藥耐藥MDR表型的穩(wěn)定細胞系,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。K562/AO2細胞維持增殖的ADM終濃度為1.0 mg·L-1。將細胞接種于含體積分數(shù)為10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37℃、體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,2~3 d傳代1次。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗,實驗前無藥培養(yǎng)3 d。

    1.3 實驗分組

    實驗時取對數(shù)生長期細胞,計數(shù)活細胞數(shù)在98%以上,根據(jù)實驗設(shè)計分組:(1)K562陰性對照組(未加藥);(2)K562/AO2陽性對照組(未加藥);(3)ADM干預(yù)的K562/AO2組;(4)苦參堿干預(yù)的K562/AO2組;(5)塞來昔布干預(yù)的K562/AO2組;(6)苦參堿聯(lián)合塞來昔布干預(yù)的K562/AO2組;(7)苦參堿聯(lián)合ADM干預(yù)的K562/AO2組;(8)塞來昔布聯(lián)合ADM干預(yù)的 K562/AO2組;(9)苦參堿、塞來昔布聯(lián)合ADM干預(yù)的K562/AO2組。

    1.4 MTT法檢測細胞毒性作用

    取對數(shù)生長期人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞敏感株K562及其耐藥細胞株K562/AO2分別調(diào)整細胞濃度至約2×105ml-1,以每孔200μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,在CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。2~4 h后加入不同濃度藥物,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)24或48 h后加入20μl MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO),充分溶解結(jié)晶物,平板振蕩儀振蕩10 min,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長492 nm時的OD值,計算細胞抑制率,求出半數(shù)抑制劑量(IC50)。藥物對細胞生長抑制率=(1-實驗組吸光度A/對照組吸光度A)×100%;耐藥倍數(shù)=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50;增敏倍數(shù)=耐藥細胞IC50/加逆轉(zhuǎn)劑后IC50。

    1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

    將細胞懸液密度調(diào)成8×104ml-1,分別加入ADM、苦參堿、塞來昔布以及苦參堿聯(lián)合塞來昔布、ADM。另設(shè)對照組(未加藥),置37℃、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后1 ml冷PBS離心洗滌2 次(1 500 r·min-1,5 min),倒掉上清液,加入 500 μl結(jié)合緩沖液和5μl Annexin V-FITC重懸后室溫下避光放置20 min,然后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。每組實驗重復(fù)3次,取均數(shù)。

    1.6 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2 mRNA

    分別收集經(jīng)ADM、苦參堿、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用后48 h的K562/AO2的各組細胞及對照組細胞。用Trizol法提取各組總RNA,然后利用RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA,并取一定量cDNA加入目的基因引物片段進行PCR反應(yīng)生成目的DNA基因復(fù)制產(chǎn)物,從而半定量測定目的基因mRNA的表達,未反應(yīng)cDNA保存于-20℃。本實驗PCR體系總體積為25μl,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,退火30 s(內(nèi)參GAPDH退火溫度為53℃,MDR1和COX-2基因退火溫度為55℃),72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸7 min。以MDR1/GAPDH DNA和COX-2/GAPDH DNA光密度比值作為各組實驗資料;每組實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.7 Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白的表達

    分別收集經(jīng)ADM、苦參堿、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用后48 h的K562/AO2的各組細胞及對照組細胞后提取蛋白質(zhì),BCA法(BCA試劑盒購自碧云天公司)測定蛋白質(zhì)含量。等量蛋白質(zhì)采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,室溫下?lián)u動封閉4 h后加入鼠抗人COX-2和P-gp抗體,在4℃過夜,室溫下洗膜后加入堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG抗體,室溫孵育1 h;洗去未結(jié)合的二抗,加新鮮配置的顯色液,避光顯色20 min后終止反應(yīng)。P-gp和COX-2蛋白表達值為條帶的灰度值除以β-actin內(nèi)參校正;每組實驗重復(fù)3次,取均值。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    數(shù)據(jù)用±s表示,兩樣本均數(shù)比較用方差檢驗,采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5進行統(tǒng)計學(xué)處理。顯著性檢驗采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 逆轉(zhuǎn)劑及逆轉(zhuǎn)劑處理前后對K562細胞和K562/AO2細胞的毒性作用

    ADM對K562/AO2細胞和K562細胞的IC50分別為 (33.31 ±2.51)、(0.40 ±0.03)μg·ml-1,耐藥倍數(shù)為83.69倍。苦參堿對 K562的IC50為(1 290.33±53.45)μg·ml-1,對 K562/AO2 的 IC50為(1 342.33 ±33.50)μg·ml-1,塞來昔布對K562的IC50為 (45.97±1.05)μg·ml-1,對 K562/AO2 的 IC50為(45.68 ±0.15)μg·ml-1,二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義??鄥A在≤225 μg·ml-1,塞來昔布在≤11.5 μg·ml-1時對細胞無明顯毒性作用(對細胞的生長抑制率<10%)。我們選用苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1為單獨及聯(lián)合用藥時的逆轉(zhuǎn)濃度,通過實驗發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用時毒性并沒有增加??鄥A(200μg·ml-1)及塞來昔布(7.5μg·ml-1)單獨及聯(lián)合應(yīng)用于K562/AO2細胞時,ADM 對 K562/AO2細胞的 IC50分別為 9.44、12.84、2.71 μg·ml-1,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為 3.53、2.60、12.29倍。而對K562細胞IC50值并無明顯影響(圖1)。

    圖1 各組藥物干預(yù)48 h后對K562/AO2細胞的抑制率

    2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

    225μg·ml-1苦參堿及11.5 μg·ml-1塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用,對于K562/AO2細胞均沒有明顯的毒副作用。我們選定苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5 μg·ml-1、ADM 2 μg·ml-1為作用濃度,對于K562/AO2細胞其陽性對照組凋亡率為(3.25±0.53)%,單用ADM組凋亡率為(4.81±1.25)%,苦參堿聯(lián)合ADM組其凋亡率為(15.31±1.07)%,塞來昔布聯(lián)合ADM組其凋亡率為(12.72±0.98)%,而苦參堿、塞來昔布與ADM聯(lián)合應(yīng)用時凋亡率為(29.82±0.23)%,可見應(yīng)用逆轉(zhuǎn)劑組凋亡率顯著增高,且兩逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)合應(yīng)用時凋亡率最高。見圖2。

    圖2 各組藥物干預(yù)K562/AO2細胞48 h后對凋亡率的影響

    2.3 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2基因

    對照組K562細胞和K562/AO2細胞的MDR1 DNA條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值分別為(3.72±1.62)%和(127.90±1.78)%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組K562細胞和K562/AO2細胞的COX-2基因條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度比值分別為(1.47±0.86)%和(50.84±2.80)%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。苦參堿、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后,MDR1與GAPDH的比值分別為(70.76±9.65)%、(78.44±2.36)%和(30.57±5.99)%;苦參堿、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后,COX-2基因與GAPDH的比值分別為(26.42±3.29)%、(24.56±1.13)%和(8.36±2.83)%。加用逆轉(zhuǎn)劑后與對照組相比有明顯差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義,以兩個逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用時最明顯。見圖3~5。

    圖3 各組藥物干預(yù)K562/AO2細胞48 h后COX-2mRNA內(nèi)參表達的變化

    圖4 各組藥物干預(yù)K562/AO2細胞48 h后COX-2mRNA表達的變化

    2.4 Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白的表達

    對照組K562細胞和K562/AO2細胞的P-gp條帶與內(nèi)參條帶灰度比值分別為(2.02±0.47)%和(83.72±6.97)%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);對照組K562細胞和K562/AO2細胞的COX-2蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度比值分別為(1.33±0.48)%和(83.18±5.49)%,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)??鄥A、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后P-gp與內(nèi)參的比值分別為(51.90±2.57)%、(40.62±4.51)%和(13.30±1.37)%;苦參堿、塞來昔布單獨及聯(lián)合應(yīng)用ADM 48 h后COX-2蛋白與內(nèi)參的比值為(50.82±6.30)%、(41.19±10.42)%和(13.75±6.12)%。加用逆轉(zhuǎn)劑后與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,以兩個逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用時最明顯。見圖6。

    3 討 論

    化學(xué)治療是目前治療惡性腫瘤,包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要手段之一?;熯^程中由于多數(shù)腫瘤細胞具有遺傳不穩(wěn)定性,易于突變而產(chǎn)生的MDR是造成化療中斷、導(dǎo)致治療失敗的主要因素之一,也是腫瘤細胞對化療藥物毒性損傷最重要的自我保護防御機制之一。

    腫瘤細胞的MDR產(chǎn)生的機制是復(fù)雜多樣的,可能的機制主要有:(1)藥物外排;(2)抗細胞凋亡;(3)其他,包括藥物代謝酶活性的變化(如GST、TopoⅡ、PKC)、DNA損傷修復(fù)能力增強、微環(huán)境耐藥、激素受體量和親和力改變等機制。目前較多的研究表明,腫瘤細胞產(chǎn)生MDR的主要原因是MDR1/P-gp的高表達。因而干預(yù)和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的MDR,提高化療敏感性對惡性血液病的治療有積極意義[4-5]??朔嗨幠退幍姆椒ㄖ皇鞘褂媚孓D(zhuǎn)劑,逆轉(zhuǎn)MDR能夠使化療失敗的幾率下降具有很高的臨床價值,MDR逆轉(zhuǎn)已成為目前國內(nèi)外化療藥物研究的重要方向之一。

    圖5 各組藥物干預(yù)K562/AO2細胞48 h對MDR1mRNA表達的影響

    圖6 各組藥物干預(yù)K562/AO2細胞48 h蛋白表達情況

    近年來的研究發(fā)現(xiàn)許多癌前病變和惡性腫瘤有COX-2的過度表達,COX-2同時具有環(huán)氧化物酶和過氧化物酶兩種酶的活性,在腫瘤細胞的惡性進程中對細胞周期、細胞凋亡、腫瘤血管形成以及腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移等均存在一定的關(guān)聯(lián)性[6-7]。COX-2促進腫瘤發(fā)生的分子機制主要有:(1)促進腫瘤新生血管的生成;(2)刺激腫瘤細胞的增殖;(3)抑制腫瘤細胞的凋亡;(4)促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移;(5)抑制機體的免疫反應(yīng);(6)參與前致物的活化。目前,COX-2及其抑制劑已成為抗腫瘤研究的又一熱點,有研究報道COX-2抑制劑對細胞增殖的影響作用途徑之一可能是通過調(diào)節(jié)P-gp的表達來實現(xiàn)[8]。COX-2抑制劑用于實體瘤的多藥耐藥研究已有報道,用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的多藥耐藥的研究報道不多。本研究將基于近年來應(yīng)用單藥苦參堿或COX-2抑制劑塞來昔布逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的基礎(chǔ)上采用兩藥聯(lián)合應(yīng)用的方法,進一步觀察兩藥聯(lián)合用于血液腫瘤時對多藥耐藥的影響。因中藥本身具有抗癌作用或者可以通過調(diào)節(jié)機體免疫功能等協(xié)同化療藥物殺死腫瘤細胞,且中藥又具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小等特點,我們選用中西藥聯(lián)合作為逆轉(zhuǎn)劑,通過兩種藥物的協(xié)同作用可以使單藥的劑量減小,在獲得更好的治療效果的同時減少了毒副反應(yīng)。

    本研究中MTT法實驗結(jié)果顯示:苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1對K562細胞系和K562/AO2細胞系均無直接細胞毒性??鄥A200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1能明顯增強 ADM對 K562/AO2細胞系的殺傷作用。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的實驗結(jié)果表明苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1能顯著增加ADM(2μg·ml-1)對K562/AO2細胞的凋亡率,單獨應(yīng)用 ADM時其凋亡率為(4.81±1.25)%,苦參堿聯(lián)合 ADM時凋亡率為(15.31±1.07)%,塞來昔布聯(lián)合ADM時凋亡率為(12.72±0.98)%,苦參堿和塞來昔布聯(lián)合ADM時凋亡率為(29.82±0.23)%。RT-PCR實驗結(jié)果顯示,K562/AO2細胞系的MDR1和COX-2mRNA高表達??鄥A、塞來昔布單獨加用ADM作用時均可不同程度地使MDR1和COX-2mRNA表達下調(diào),聯(lián)合應(yīng)用時下調(diào)明顯,且MDR1和COX-2mRNA的表達具有明顯的一致性。在Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白表達的實驗中顯示了和RT-PCR實驗一致的結(jié)果。本研究顯示的化療藥物可通過誘導(dǎo)COX-2的表達以及COX-2的表達與P-gp表達的相關(guān)性結(jié)果,為MDR產(chǎn)生機制的研究提供新的方向,且對MDR的逆轉(zhuǎn)開辟了新的思路,COX-2選擇性抑制劑的使用可能成為臨床上逆轉(zhuǎn)MDR的選擇之一,有望提高抗腫瘤藥物療效。

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