內(nèi)皮祖細胞在早期急性腎缺血再灌注損傷中的抗凋亡作用觀察

陳波，薄成佳，賈瑞鵬，朱佳庚，李文成，吳然，劉昊，葛余正

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210006)

急性腎功能衰竭是臨床上常見的急危重癥，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是其主要原因之一，病死率可高達50% ～80%［1］。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展，干細胞在急、慢性腎臟疾病治療中的應(yīng)用正日益受到關(guān)注。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)作為一種具有定向歸巢、增殖、分化為成熟內(nèi)皮細胞特性的多能干細胞，在缺血性心臟病、急性肺損傷、高血壓病等多種疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用［2-4］。Patschan 等［5］報道，由缺血性損傷動員的EPC可對腎臟缺血組織產(chǎn)生保護性作用，但其研究未涉及EPC在抗細胞凋亡方面的作用。因此，我們擬觀察同種異體EPC移植對腎IRI急性期的治療效果并探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠［購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SPF級)］;EGM-MV培養(yǎng)基(Lonza公司);淋巴細胞分離液(上海華精生物高科技有限公司);胰酶/EDTA(Gibco公司);兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(Santa公司);TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司);蛋白質(zhì)印跡檢測試劑盒(Bio-Rad);CM-Dil(氯甲基苯甲酰氨熒光染料V-228888)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)。

1.2 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠30只，體重230～250 g，隨機分為EPC移植組(EPC組)、缺血再灌注損傷組(IRI組)和假手術(shù)組，每組10只。EPC組:游離雙側(cè)腎蒂，夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，恢復(fù)血流灌注后股靜脈注入0.5 ml經(jīng)CM-Dil標記的 EPC懸液(細胞密度1.0×106L-1);IRI組:游離雙側(cè)腎蒂，夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，恢復(fù)血流灌注后股靜脈注入0.5 ml生理鹽水;假手術(shù)組:游離雙側(cè)腎蒂，暴露45 min后股靜脈注入EPC懸液(劑量同EPC組)。分別于建模后72 h處死各組大鼠。

1.3 EPC的分離、培養(yǎng)、鑒定和標記

Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠骨髓源性單個核細胞。健康雄性SD大鼠，體重130～150 g，大鼠頸椎脫臼處死，于無菌條件下獲取股骨和脛骨，PBS液沖出骨髓組織，將沖洗液輕置于淋巴細胞分離液上，2 500 r·min-1離心 30 min，取中間相細胞層，PBS 清洗2次，加入EGM-2MV培養(yǎng)基制成細胞懸液［6］，細胞計數(shù)后加入25 cm2培養(yǎng)瓶(纖維連接蛋白包被)，于37℃、體積分數(shù)為5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后可進行免疫組織化學(xué)染色(CD31、CD34、Ⅷ因子)鑒定 EPC 及細胞活力［7］。

1.4 EPC的標記

DMSO 溶解CM-Dil，配成1 g·L-1的分裝溶液。取CM-Dil分裝溶液 1 μl，PBS 液稀釋至2 mg·L-1，重懸于收集培養(yǎng)10 d的EPC沉淀(細胞密度為1.0×106L-1)中，細胞接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃孵育5 min，4 ℃再孵育15 min［8］，然后于熒光顯微鏡下觀察標記后的EPC特征。

1.5 觀察內(nèi)容和檢測指標

1.5.1 腎功能的測定 分別于腎IRI后24、48 h從大鼠尾靜脈采血，分離血清后置于-20℃冰箱保存，使用日立全自動生化分析儀酶法測定大鼠尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)濃度。

1.5.2 腎組織病理學(xué)檢查及EPC示蹤 左腎固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色，進行病理分析;右腎行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察EPC的歸巢情況。腎小管損傷定義為腎小管壞死或刷狀緣脫落、管型形成、管腔擴張，每張切片計算10個視野(×200)。按受損比例進行腎小管間質(zhì)損傷程度評分(HSK):無病變?yōu)?分;＜25%為1分;25%≤損傷比例＜50%為2分;50%≤損傷比例＜75%為3分;≥75%為4分。分值越高表示損傷越重。

1.5.3 細胞凋亡檢測 采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(TUNEL)法檢測，按試劑盒說明書操作，凋亡指數(shù)(apoprotic index，AI)采用以下方法計算:每張切片至少計數(shù)500個細胞，以每100個細胞內(nèi)的陽性細胞數(shù)作為凋亡指數(shù)，用百分數(shù)表示。

1.5.4 蛋白質(zhì)印跡檢測 提取組織蛋白，測定蛋白濃度，蛋白上樣，行PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗大鼠VEGF多克隆抗體4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，曝光、顯影、成像。應(yīng)用Image J圖像分析軟件對特異性條帶進行吸光度分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EPC分離、培養(yǎng)、鑒定、標記及其在IRI腎組織的分布

EPC的形態(tài)學(xué)特征:新獲取的大鼠骨髓源性單個核細胞呈圓形，大小不一，胞質(zhì)透亮，胞核清晰。培養(yǎng)2～3 d后即可良好貼壁，4～8 d時細胞呈三角形、梭形或不規(guī)則形，并出現(xiàn)細胞集落，14 d時呈現(xiàn)EPC特有的條索狀或鋪路石狀，細胞形態(tài)規(guī)則，生長穩(wěn)定。每代生長時間為4～6 d，待細胞融合到80%進行傳代，可獲得大量的、穩(wěn)定的 EPC［7］。

采用倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)的EPC，在綠色光的激發(fā)下，CM-Dil標記的EPC發(fā)出紅色熒光，而未標記的EPC未發(fā)出紅色熒光，提示已成功標記了EPC，標記率接近100%(圖1A)。移植組腎組織冰凍切片示:EPC移植后72 h可見CM-Dil陽性細胞彌散分布在腎臟皮髓交界處，發(fā)出紅色熒光，形態(tài)與培養(yǎng)的EPC符合(圖1B)。而IRI組和假手術(shù)組組未見CM-Dil陽性細胞，提示細胞來源于經(jīng)股靜脈移植入大鼠體內(nèi)的EPC。

圖1 EPC標記和示蹤Fig 1 EPC labeling and trace

2.2 EPC對IRI后腎功能的影響

腎 IRI后24 h，EPC 組、IRI組大鼠 BUN、Scr水平較假手術(shù)組顯著升高;腎IRI后48 h，EPC組、IRI組大鼠BUN、Scr水平仍高于假手術(shù)組;且 EPC組大鼠BUN、Scr水平較同一時間點的IRI組均有顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

腎IRI后24 h，移植組與 IRI組比較，BUN:F=11.968，P ＜0.05;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植組與假手術(shù)組比較，BUN:F=101.128，P＜0.01;Scr:F=17.142，P ＜0.05。腎 IRI后48 h，移植組與 IRI組比較，BUN:F=26.32，P ＜0.01;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植組與假手術(shù)組比較，BUN:F=15.366，P＜0.05;Scr:F=16.651，P ＜0.05。

2.3 EPC對IRI后腎組織損傷的影響

腎IRI后72 h，HE染色示假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，IRI組大鼠腎臟病理損傷顯著，主要集中于皮髓交界和外髓的近端小管，表現(xiàn)為小管上皮細胞壞死、脫落、空泡變性，刷狀緣脫落明顯，部分腎小管基膜裸露形成裸膜，管腔中可見脫落的小管上皮細胞，間質(zhì)水腫，炎癥細胞浸潤。EPC組亦可見空泡變性，但腎組織損傷程度較對照組明顯減輕(圖2)。

圖2 腎組織HE染色Fig 2 HE staining of renal tissue

腎小管損間質(zhì)傷程度評分:IRI后72 h，EPC組的HSK評分為2.0±0.1，低于 IRI組(3.0±0.2)(H=95.386，P ＜0.01)，高于假手術(shù)組(0.5±0.2)(H=26.074，P ＜0.01)。

2.4 EPC對IRI后腎小管上皮細胞凋亡的影響

腎IRI后72 h，IRI組可見明顯的腎小管上皮細胞凋亡(TUNEL陽性)，凋亡細胞主要集中在皮髓交界和外髓質(zhì)，腎小球內(nèi)凋亡細胞較少。IRI組細胞凋亡指數(shù)(29.7±6.7)較IRI組(66±10.5)顯著降低(P＜0.01)，而假手術(shù)組幾乎未見凋亡細胞(圖3、4)。

圖3 腎組織凋亡細胞染色Fig 3 Staining of renal tubular epithelial cell apoptosis

2.5 EPC對IRI后VEGF蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比，再灌注后72 h EPC組和IRI組VEGF蛋白表達升高，但EPC組表達量顯著高于IRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4、5)。

圖4 各組大鼠VEGF蛋白表達的比較Fig 4 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

圖5 各組大鼠VEGF蛋白表達的比較Fig 5 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

3 討 論

EPC作為一種定向分化為內(nèi)皮細胞的骨髓源性干細胞，可對多種器官缺血性損傷產(chǎn)生修復(fù)作用［2-3，9］，逐漸引起了人們的重視。創(chuàng)傷、缺血、缺氧等因素均可刺激骨髓中EPC向外周血遷移、動員，對損傷的血管內(nèi)皮產(chǎn)生修復(fù)作用［10］。但自身動員的EPC數(shù)量較少，不足以修復(fù)受損組織［11］，因此，EPC的體外擴增和移植為EPC研究的重要手段。

本實驗通過體外分離、誘導(dǎo)、純化、培養(yǎng)EPC并進行外源性移植入腎IRI大鼠，在移植后的24和48 h，EPC組大鼠腎功能相關(guān)指標雖高于假手術(shù)組，但其損傷程度較IRI組有明顯改善，提示EPC移植在腎IRI早期即可發(fā)揮保護作用。EPC移植后72 h，移植大鼠腎組織內(nèi)可見CM-Dil陽性EPC，主要位于腎臟皮髓交界處，而假手術(shù)組和IRI組未見CM-Dil陽性細胞，說明EPC能感知腎組織損傷而向損傷部位歸巢，對血管內(nèi)皮產(chǎn)生修復(fù)作用，保護受損腎臟。同時，EPC組的HSK評分及病理損傷程度顯著低于IRI組，表明移植的EPC可能會啟動內(nèi)源性再生，促進腎小管上皮細胞自身的增殖、分化從而發(fā)揮修復(fù)作用［12-13］。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，在腎IRI后72 h，損傷腎組織不但存在腎小管空泡變性和細胞壞死脫落，還存在大量的凋亡細胞。凋亡是細胞死亡的特殊類型，與細胞壞死比較，凋亡(尤其是病變的早期)更容易通過藥理學(xué)途徑的干預(yù)得到逆轉(zhuǎn)。本實驗結(jié)果顯示，IRI組大鼠的腎小管上皮細胞核TUNEL陽性比例較高，給予EPC移植后，凋亡指數(shù)明顯降低，提示EPC移植有助于減輕IRI大鼠腎小管上皮細胞的凋亡，阻止腎損害的進展。

細胞凋亡受多種因素的調(diào)控，而VEGF是被公認的內(nèi)皮細胞和上皮細胞凋亡的抑制劑［14］。本實驗結(jié)果提示，EPC組VEGF含量顯著高于IRI組及假手術(shù)組，移植的EPC可能通過自分泌/旁分泌作用分泌VEGF等細胞因子，對抗凋亡，這可能是對抗腎小管上皮細胞凋亡的重要因素，但確切的機制尚需進一步探討。

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