幾種冷凍稀釋液與單胺類防凍劑對中緬樹鼩精子冷凍存活率的影響

平述煌, 王彩云, 唐文如, 羅 瑛, 楊世華

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650500)

幾種冷凍稀釋液與單胺類防凍劑對中緬樹鼩精子冷凍存活率的影響

平述煌, 王彩云, 唐文如, 羅 瑛, 楊世華*

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650500)

該文實(shí)驗(yàn)精子采自昆明地區(qū)經(jīng)籠養(yǎng)馴化的樹鼩(Tupaia belangeri), 檢測其冷凍前后運(yùn)動(dòng)度、頂體完整率以及檢測部分冷凍精子的受精能力。實(shí)驗(yàn)一：選用8種已報(bào)道的冷凍稀釋液TTE、TCG、TCF、TTG、BWW、BTS、DM、SR稀釋鮮精，并添加0.4 mol/L DMSO，4℃預(yù)冷平衡2h后，TTE、DM和SR稀釋液的精子的運(yùn)動(dòng)度與鮮精無差別(P＞0.05)，其余處理組均顯著下降(P＜0.05)。冷凍復(fù)蘇后，各組的運(yùn)動(dòng)度顯著低于預(yù)冷平衡處理后的運(yùn)動(dòng)度(P＜0.05)；DM組的復(fù)蘇運(yùn)動(dòng)度顯著高于其他稀釋液組(P＜0.05)，BWW組最低(P＜0.05)。對于頂體完整率，與鮮精相比，4℃平衡2h后，TTE和DM組精子的頂體完整率顯著高于BWW、BTS和SR組(P＜0.05)。冷凍復(fù)蘇后，DM組精子的頂體完整率顯著高于其它（除了TTE）冷凍組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)二：在DM稀釋液基礎(chǔ)上分別添加4種濃度0.2、0.4、0.8和1.2 mol/L的二甲基甲酰胺（DF）、甲酰胺（F）、二甲乙酰胺（DA）和乙酰胺（A）以及0.4 mol/L DMSO，經(jīng)過預(yù)冷平衡處理后，與鮮精相比，各防凍劑組的精子運(yùn)動(dòng)度沒有下降(P＞0.05)；冷凍解凍后，各冷凍組精子的運(yùn)動(dòng)度顯著低于預(yù)冷平衡處理后的精子運(yùn)動(dòng)度(P＜0.05)；0.8 mol/L DF和0.4 mol/L DMSO組精子的運(yùn)動(dòng)度顯著高于其它冷凍組(P＜0.05)。對于頂體完整率，預(yù)冷平衡處理后各高濃度組的比率顯著下降；冷凍復(fù)蘇后，0.4 mol/L F 和0.4 mol/L DF組精子的頂體完整率相對較高。實(shí)驗(yàn)三，人工授精實(shí)驗(yàn)中，DM+0.8 mol/L DF冷凍精子的受精率為16.7%，DM+0.4 mol/L DMSO的受精率為50.0%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，含卵黃的非離子冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍保護(hù)效果好，但單胺類防凍劑的防凍效果還需進(jìn)一步深入研究。

樹鼩; 精子冷凍保存; 冷凍稀釋液; 單胺類防凍劑

樹鼩具有許多靈長類動(dòng)物的特征(Poonkhum et al, 2000), 被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中, 如神經(jīng)生物學(xué)(Remple et al, 2007)、人類病毒性肝炎(Xu et al, 2007; Li et al, 2009)、視覺系統(tǒng)發(fā)育(Poveda & Kretz , 2009)、群體社會(huì)階層應(yīng)激(Kozicz et al, 2008; Zambello et al, 2010)、生殖和發(fā)育生物學(xué)(Collins et al, 2007)等。不僅如此, 它的體型小, 世代周期短、繁殖效率高, 將會(huì)越來越多地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。由于樹鼩具有比較豐富的遺傳多樣性(Chen et al, 2011), 精子冷凍能夠經(jīng)濟(jì)、有效地保存有價(jià)值的遺傳資源, 但到目前為止, 僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了冷凍降溫速率、冷凍平衡時(shí)間和冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍存活率的影響(Ping et al, 2011), 而其他冷凍稀釋液和冷凍劑對樹鼩精子的冷凍影響以及能否提高冷凍存活率還有待研究。

冷凍稀釋液是影響精子冷凍存活率和受精能力的一個(gè)重要因素, 而關(guān)于樹鼩精子冷凍稀釋液的選擇, 僅有一篇文獻(xiàn)比較了基于Tris-TES的兩種冷凍稀釋液——TTE和TEST對樹鼩精子冷凍存活率的影響(Ping et al, 2011)。然而, 已經(jīng)有很多種稀釋液被應(yīng)用于哺乳動(dòng)物精子冷凍保存中, 如基于Tris-TES的TTE和TTG分別用于非人靈長類動(dòng)物和羊的精子冷凍保存 (Si et al, 2000: Li et al, 2005);基于Tris-Citric acid的TCG和TCF稀釋液用于山羊(Santiago-Moreno et al, 2008)、牛(Rasul et al, 2001)、兔(Moce et al, 2003)和狗(Yildiz et al, 2000)的精子冷凍保存; 基于鹽和糖的BWW和BTS稀釋液用于人類(Martins et al, 2003)和豬(Yeste et al, 2008) 的精子冷凍保存; 基于Lactose-egg yolk的DM稀釋液可用于食蟹猴(Li et al, 2006)的精子冷凍保存, 且可以提供類似于TTE液的冷凍保護(hù)作用;基于Skim milk- Raffinose的SR稀釋液被廣泛用于小鼠(Sztein et al, 2000)精子的冷凍保存。盡管有很多冷凍稀釋液被用于哺乳動(dòng)物精子的冷凍保存, 但僅有為數(shù)不多的文獻(xiàn)比較了幾種冷凍稀釋液對靈長類動(dòng)物精子冷凍保存的影響(Li et al, 2006; Leverage et al,1972; Chen et al, 1994)。同時(shí), 哺乳動(dòng)物精子冷凍保存的方法多數(shù)傾向于經(jīng)驗(yàn)性和實(shí)驗(yàn)性。因此, 有必要比較多種冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍保存的影響, 以便探索適合樹鼩精子冷凍保存的冷凍稀釋液。

在精子冷凍過程中, 防凍劑是影響精子存活率的另一個(gè)重要因素。到目前為止, 甘油(Gly)、乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)和丙二醇(PG)作為常用的滲透性防凍劑被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物精子的深低溫冷凍保存(Si et al, 2004; Fermandez- Santos et al, 2005; Li et al, 2005; Fermandez-Santos et al, 2006; Kashiwazaki et al 2006; Farshad et al, 2009)。在前期的實(shí)驗(yàn)中, 通過比較不同濃度的甘油、乙二醇、二甲基亞砜和丙二醇對樹鼩精子冷凍存活率的影響,我們發(fā)現(xiàn)TTE+0.4 mol/L DMSO 可獲得較好的冷凍保護(hù)效果(這部分結(jié)果已經(jīng)投稿)。另外, 胺類, 如二甲基甲酰胺、甲酰胺、二甲乙酰胺和乙酰胺等也作為重要的滲透性防凍劑用于哺乳動(dòng)物精子冷凍保存, 比較二甲基甲酰胺、甲酰胺和甘油對犬精子冷凍保存的效率，表明甲酰胺具有類似甘油的冷凍保護(hù)效果(Futino et al, 2010); 比較5%二甲基甲酰胺、5%二甲乙酰胺、5%甲酰胺和3%甘油對野豬精子冷凍保存的效率，表明5%二甲乙酰胺具有最佳的冷凍保存效果(Bianchi et al, 2008); 比較甘油、二甲基亞砜、乳酰胺和乙酰胺對日本兔精子保存存活率的影響, 表明乳酰胺和乙酰胺的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于甘油(Kashiwazaki et al, 2006)。由此可見, 胺類可作為滲透性防凍劑被考慮用于哺乳動(dòng)物的精子冷凍保存。然而, 在樹鼩精子的冷凍保存中單胺類防凍劑及其與冷凍稀釋液配伍能否產(chǎn)生最佳的冷凍保存效果, 以及冷凍稀釋液和防凍劑的冷凍保護(hù)作用機(jī)制仍不清楚。因此, 本研究目的為選擇適用于樹鼩精子冷凍保存的最佳冷凍稀釋液, 并探討單胺類防凍劑類型及濃度對樹鼩精子冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 冷凍液的配制

除特殊說明外, 其它所有的化學(xué)試劑均購自Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。本實(shí)驗(yàn)選用8種精子冷凍稀釋液, 其組成成分見表1, 配制方法來源于文獻(xiàn)報(bào)道(Coulter & Foote, 1975; Tateno & Mikamo, 1987; Si et al, 2000; Dube et al, 20024; Li et al, 2005; Kaneko et al, 2006; Santiago-Moreno et al, 2006; Santiago-Moreno et al, 2009)。卵黃均取自于溶液配制當(dāng)天生產(chǎn)的雞蛋, 小心敲破蛋殼并去除蛋清,隨后用超純水沖洗完整的卵黃3～5次并用脫脂濾紙吸干卵黃周圍的水分, 用10 mL注射器小心刺破卵黃膜并吸取卵黃。將稱量好的藥品和卵黃溶于超純水并混勻, 于7 000 r/min，4 ℃離心1 h, 取上清棄沉淀, 并用鹽酸或NaOH調(diào)上清液pH值至7.0～7.2, 分裝于15 mL離心管中儲(chǔ)存于－80 ℃冰箱中待用, 其儲(chǔ)存期限不超過兩周, 使用前于37 ℃水浴中解凍。精子洗滌液為TALP-HEPES, 其配制方法見Bavister et al報(bào)道(1983)。分別加入0.2、0.4、0.8和1.2 mol/L的胺類防凍劑(二甲基甲酰胺, dimethyl-formamide, DF; 甲酰胺, formamide, F; 二甲乙酰胺, dimethylacetamide, DA; 乙酰胺, acetamide, A)于選用的冷凍稀釋液中, 以配制不同類型、不同濃度防凍劑的冷凍液; 0.4 mol/L DMSO為陽性對照, 不加防凍劑的冷凍液為陰性對照。

表1 8種精子冷凍保存稀釋液的組成成分Tab. 1 Components of eight extenders for diluting semen

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21只成年雄性樹鼩和10只成年雌性樹鼩, 體重為110～140 g, 來自昆明醫(yī)學(xué)院, 飼養(yǎng)于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房, 飼養(yǎng)時(shí)間均不超過2周。所有動(dòng)物早、中、晚均喂食高壓消毒的顆粒飼料, 并補(bǔ)充雞蛋、牛奶和新鮮水果。動(dòng)物飼養(yǎng)在100 cm×50cm×40cm(長×寬×高)的籠子中, 單只單籠，室溫20～25 ℃, 光照時(shí)間為7:00-19:00。所有實(shí)驗(yàn)均在5-7月完成。

2.3 精液采集

通過外科手術(shù)從睪丸中分離出附睪尾和輸精管, 用TLAP-HEPES沖洗離體附睪并小心去除血液和脂肪組織, 隨后將附睪尾置于含1 mL 37 ℃TLAP-HEPES的平皿中, 用精細(xì)手術(shù)剪剪碎附睪尾,繼續(xù)于37 ℃孵育10 min讓精子游離出來。取10 μL精液樣品檢測精子運(yùn)動(dòng)度和頂體完整性, 運(yùn)動(dòng)度超過60%的精子樣品用于實(shí)驗(yàn)。剩余的精子樣品用1 mL TLAP-HEPES洗2次, 250 r/min離心4 min。棄上清液, 并立即將精子沉淀用冷凍稀釋液稀釋混勻,室溫維持10 min。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)一：不同冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍存活率的影響 來自6只雄性樹鼩的每份精子樣品被均勻分成8等分, 分別用TTE、TCG、TCF、TTG、BWW、BTS、DM、SR冷凍稀釋液稀釋, 并且將這8份精子冷凍稀釋混合液置于4 ℃冰箱中預(yù)冷處理2 h, 隨后向已經(jīng)平衡好的精子冷凍稀釋混合液中加入0.4 mol/L的DMSO(我們已證實(shí)0.4 mol/L DMSO能有效保護(hù)樹鼩精子, 其結(jié)果已經(jīng)投稿), 繼續(xù)平衡預(yù)冷處理30 min, 取10 μL精子冷凍液檢測精子的運(yùn)動(dòng)度和頂體完整率, 再將剩余的精子冷凍液分別取150 μL裝入冷凍麥管中, 并用熱封機(jī)封口,每份樣品裝2管。然后, 將以上的精子冷凍液麥管置于距液氮面4 cm的位置冷凍降溫10 min, 最終將所有麥管投入液氮冷凍保存(Ping et al, 2011) 。冷凍保存精子超過3 d后, 直接從液氮中取出并投入37 ℃水浴中復(fù)蘇2 min, 用TALP-HEPES稀釋至1.5 mL, 于250 r/min離心5 min去除防凍液, 取樣檢測精子運(yùn)動(dòng)度和頂體完整性。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)二：不同滲透性防凍劑對樹鼩精子冷凍存活率的影響 來自10只雄性樹鼩的每份精子樣品被均勻分成18等份, 利用實(shí)驗(yàn)一選擇出的DM冷凍稀釋液稀釋處理, 然后將這18份含精子冷凍稀釋液置于4 ℃冰箱中預(yù)冷處理2 h, 隨后向已經(jīng)平衡好的18份精子冷凍稀釋液中, 分別加入等體積的含0.4、0.8、1.6和2.4 mol/L的滲透性防凍劑DF、F、DA、A, 以及0.8 mol/L的DMSO、無防凍劑的冷凍稀釋液，使得冷凍液中的防凍劑分別為0.2、0.4、0.8和1.2 mol/L的滲透性防凍劑DF、F、DA、A, 以及0.4 mol/L DMSO和無防凍劑的冷凍液, 繼續(xù)平衡預(yù)冷處理30 min, 取10 μL精子冷凍液檢測精子運(yùn)動(dòng)度和頂體完整率, 再將剩余的精子冷凍液分別取約150 μL裝入冷凍麥管中, 并用熱封機(jī)封口,每份樣品裝2管。然后, 將以上的精子冷凍液麥管置于距液氮面4 cm的位置冷凍降溫10 min, 最終將所有麥管投入液氮冷凍保存。冷凍保存精子超過3 d后, 直接從液氮中取出并投入37 ℃水浴中復(fù)蘇2 min, 用TALP-HEPES稀釋至1.5 mL, 于250 r/min離心5 min去除防凍劑, 取樣檢測精子運(yùn)動(dòng)度和頂體完整性。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)三：評估冷凍精子的受精能力 來自于5只雄性樹鼩的精子被均分兩等份，分別配置0.4 mol/L DMSO及0.8 mol/L DF冷凍精液。解凍后的精子分別用1 mL預(yù)熱的TALP-HEPES復(fù)蘇, 250 r/min 離心5 min洗兩次, 隨后用TALP- HEPES將精子稀釋到(2.1±0.3)×107/mL活精子的濃度。與此同時(shí), 10只雌性動(dòng)物進(jìn)行以下處理：暴露經(jīng)過誘導(dǎo)排卵處理的雌性樹鼩子宮, 將100 μL冷凍精子注射到樹鼩的兩側(cè)子宮中進(jìn)行人工授精。其中, 凍存精子的復(fù)蘇運(yùn)動(dòng)度和頂體完整率需分別不低于30%和50%。

對雌性樹鼩進(jìn)行誘導(dǎo)排卵的方法見Coscioni et al(2001)的研究報(bào)道, 對雌性樹鼩肌肉注射60 IU PMSG, 間隔24 h后分別肌肉注射30 IU PMSG和30 IU HCG。在注射HCG 8 h后, 利用冷凍精子作子宮內(nèi)人工授精, 步驟如下：利用鹽酸氯胺酮(40 mg/kg body weight)對動(dòng)物進(jìn)行麻醉處理, 隨后將樹鼩仰式固定, 刮去腹部的毛, 75%酒精消毒后用已消毒的手術(shù)剪刀在腹部正中央打開一個(gè)約7 mm的創(chuàng)口, 暴露子宮, 用16#無菌針頭在靠近子宮頸且血管分布少的地方刺洞, 接著將直徑為0.38 mm并含有100 μL冷凍精子的導(dǎo)管通過洞分別插入到兩側(cè)的子宮宮管中, 將精子注射到輸卵管的開口附近,最后利用標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)法縫合傷口并注射5 000 IU的青霉素和止痛藥以防止傷口感染和疼痛。待人工授精40 h后, 利用相同的外科手術(shù)暴露子宮、輸卵管和卵巢, 手術(shù)摘除卵巢及其輸卵管, 在體視顯微鏡下利用TALP-HEPES液收集胚胎, 倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)超排卵母細(xì)胞和已分裂成2-細(xì)胞以上胚胎的數(shù)量, 以此計(jì)算出受精率, 即受精率=2-細(xì)胞以上胚胎數(shù)量/總的超排卵母細(xì)胞數(shù)×100%(Ping et al, 2011)。

2.5 精子功能檢測

2.5.1 精子運(yùn)動(dòng)度的檢測 取10 μL精子混合液(新鮮或預(yù)冷處理后或冷凍/解凍后)滴加到已預(yù)熱至37 ℃的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上, 在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)向前運(yùn)動(dòng)度精子占整個(gè)精子群的百分比率, 其操作步驟參考相關(guān)Saragusty et al(2009)的研究報(bào)道。每次至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子, 重復(fù)兩次。注意：所有樣本的運(yùn)動(dòng)度評估均由一個(gè)熟練的操作者執(zhí)行; 解凍后的精子運(yùn)動(dòng)度應(yīng)在TALP-HEPES洗滌后, 立即計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)度;為減少評測的誤差, 操作者應(yīng)盲測所有樣本。

2.5.2 頂體完整率檢測 采用熒光染料FITC-PNA檢測精子的頂體完整率, 其操作見文獻(xiàn)報(bào)道(Bathgate et al, 2006)：將精子樣品用TALP-HEPES離心洗2次, 稀釋至適當(dāng)精子濃度, 取20 μL滴在載玻片上, 風(fēng)干后, 在通風(fēng)櫥中用甲醇溶液固定。待風(fēng)干后, 加入40 μg/mL的 FITC-PNA與精子樣品在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min, PBS洗去多余的染料, 在熒光顯微鏡下檢查, 其激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為490 nm和515 nm, 頂體完整的精子被染成均勻的蘋果綠色, 而頂體不完整的精子部分著色或不著色。計(jì)數(shù)頂體完整和不完整的精子, 每次至少計(jì)數(shù)200個(gè), 并計(jì)算頂體完整率。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示, 精子運(yùn)動(dòng)度、運(yùn)動(dòng)度復(fù)蘇率和頂體完整率等百分率數(shù)據(jù)經(jīng)過平方根的反正弦轉(zhuǎn)換, 經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one way ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(1east significant difference test)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異顯著性; 利用Paired-Samplest-test比較鮮精和冷凍精子的受精率;P＜0.05為差異顯著。以上所有數(shù)據(jù)的處理及文章中圖均通過SPSS 11.5 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 軟件完成。

3 結(jié) 果

3.1 不同冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍存活率的影響

冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍-解凍運(yùn)動(dòng)度的影響見表2。相比鮮精而言, 經(jīng)過預(yù)冷平衡處理后, TTE、DM和SR稀釋液稀釋的精子的運(yùn)動(dòng)度未顯著性下降(P＞0.05), 而其余冷凍稀釋液稀釋的精子卻顯著性下降(P＜0.05), 且BWW、TTG、BTS組顯著低于其他冷凍稀釋液組(P＜0.05)。冷凍復(fù)蘇后, 各稀釋液組復(fù)蘇精子的運(yùn)動(dòng)度顯著低于預(yù)冷平衡處理后的運(yùn)動(dòng)度(P＜0.05); DM組冷凍解凍精子的運(yùn)動(dòng)度顯著高于其它稀釋液冷凍組(P＜0.05); TTE和SR組, 顯著高于TTG、BWW和BTS組(P＜0.05); BWW冷凍組精子的運(yùn)動(dòng)度最低(P＜0.05)。

冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍解凍后頂體完整率的影響見表3。相比鮮精, TCF、BWW、BTS和SR組平衡后頂體完整率顯著性下降(P＜0.05), 而TTE和DM組精子的頂體完整率顯著高于BWW、BTS和SR組(P＜0.05)。冷凍解凍后, DM組精子的頂體完整率顯著高于其他冷凍組(P＜0.05), 但與TTE組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。

3.2 不同滲透性防凍劑對樹鼩精子冷凍存活率的影響

不同防凍劑對樹鼩冷凍解凍精子運(yùn)動(dòng)度的影響見表4。相比鮮精, 經(jīng)過預(yù)冷平衡處理后, 各防凍劑組的精子運(yùn)動(dòng)度未顯著性下降(P＞0.05)。經(jīng)過冷凍解凍后, 各組精子的運(yùn)動(dòng)度顯著低于其預(yù)冷平衡處理后的精子運(yùn)動(dòng)度(P＜0.05); 0.8 mol/L DF組精子的運(yùn)動(dòng)度顯著高于其它冷凍組, 但與0.8 mol/L A和0.4 mol/L DMSO組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)

表2 比較8種不同冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍-解凍運(yùn)動(dòng)度的影響(n=6)Tab. 2 Effects of eight extenders on motility during sperm cryopreservation in tree shrews (n=6)

表3 比較8種不同冷凍稀釋液對樹鼩精子冷凍-解凍頂體完整率的影響Tab. 3 Effects of eight extenders on acrosome integrity in sperm cryopreservation of tree shrews (n=6)

表4 胺類防凍劑對樹鼩精子冷凍-復(fù)蘇后精子運(yùn)動(dòng)度的影響(n=10)Tab. 4 Effects of monoamines on motility in sperm cryopreservation in tree shrews (n=10)

不同防凍劑對樹鼩冷凍解凍精子的頂體完整率的影響見表5。經(jīng)過預(yù)冷平衡處理后, 0.2 mol/L DF、0.8 mol/L DA、0.8 mol/L A、0.2 mol/L A和無防凍劑組的頂體完整率顯著高于1.2 mol/L DF、0.8 mol/L F和1.2 mol/L F組(P＜0.05)。冷凍解凍后, 0.4 mol/L F 和0.4 mol/L DF組精子的頂體完整率顯著高于1.2 mol/L DF、0.2 mol/L F、0.8 mol/L DA和1.2 mol/L DA組(P＜0.05)。

3.3 冷凍精子受精能力的檢測結(jié)果

如表6所示, 0.8 mol/L DF冷凍精子的受精率(16.7%)與0.4 mol/L DMSO的受精率(50.0%)有顯著性差異(P＜0.05)。

4 討 論

本研究首次比較了8種常用冷凍稀釋液和4種單胺類滲透性防凍劑對樹鼩精子冷凍存活率的影響。Ping et al (2011)報(bào)道, 適用于樹鼩精子冷凍的最佳卵黃濃度、降溫速率和冷凍降溫平衡時(shí)間分別為20%、–172 ℃/min和10 min; 通過比較甘油、乙二醇、二甲基亞砜和丙二醇對樹鼩精子冷凍存活率的影響, 結(jié)果表明最佳的防凍劑為0.4 mol/L DMSO,但是仍然存在可提升的冷凍效率空間, 故本次研究在此基礎(chǔ)上探討冷凍稀釋液和胺類防凍劑對樹鼩精子冷凍效率的影響, 以優(yōu)化樹鼩精子冷凍保存方

法。探討冷凍稀釋液和胺類滲透性防凍劑對樹鼩這一物種精子的低溫生物學(xué)特性無疑將有助于提高樹鼩精子冷凍保存效率, 為建立一套完整高效可行的低溫冷凍方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù), 這將有利于提高樹鼩在生物醫(yī)學(xué)中的利用率。

表5 防凍劑對樹鼩精子冷凍-復(fù)蘇后精子頂體完整率的影響(n=10)Tab. 5 Effects of monoamines on acrosome integrity in sperm cryopreservation in tree shrews (n=10)

表6 0.8 mol/L DF和0.4 mol/L DMSO冷凍精子的受精能力Tab. 6 Fertilizing ability of tree shrew sperm frozen with 0.8 mol/L DF and 0.4 mol/L DMSO

在精子冷凍保存過程中, 冷凍稀釋液成分具有極其重要的作用。這8種冷凍稀釋液被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的精子冷凍保存過, 并且因物種的不同而冷凍效果不同。比較基于Tris-TES的兩種冷凍稀釋液(即TTE和TEST)對樹鼩精子冷凍存活率的影響,結(jié)果表明, TTE的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于TEST, 其原因可能是高濃度的三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris)和三甲基氨基乙磺酸(TES)對樹鼩精子造成鹽害而受損傷或乳糖和棉子糖給樹鼩精子冷凍提供較好的保護(hù)作用 (Garde et al, 2008; Ping et al, 2011)。在此8種冷凍稀釋液中, TTE和TTG是以Tris-TES為緩沖體系的稀釋液, 但TTE的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于TTG,其原因可能是TTG中的Tris-TES濃度高于TTE且TTE中的糖濃度和種類多于TTG, 這與Ping et al (2011)報(bào)道的結(jié)果一致; TCG和TCF是基于Tris-citric acid的稀釋液, 雖然TCG的鹽濃度高于TCF, 但是冷凍保護(hù)效果一樣, 其原因可能TCG中Tris的濃度升高不足加劇負(fù)面影響; BWW和BTS是基于鹽和葡萄糖的兩種稀釋液, 對樹鼩精子的冷凍保護(hù)效果最差, 其原因可能是缺少卵黃, 或者鹽的存在; DM的主要成分為乳糖和卵黃, 對樹鼩精子的冷凍保存效率最高, 與TTE、TTG、TCF、TCG相比, DM稀釋液中沒有Tris-TES和鹽分的存在; SR的主要組成成分為棉子糖和脫脂奶, 但其冷凍保存效率低于DM, 其原因可能是卵黃的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于脫脂奶。綜上所述, 在樹鼩精子冷凍保存過程中, 卵黃是冷凍稀釋液中不可缺少的的成分, 但是過多的Tris-TES和金屬離子可能易造成樹鼩精子冷凍損傷。

在哺乳動(dòng)物的精子冷凍保存中, 最常用的滲透性防凍劑是甘油, 其次是乙二醇和二甲基亞砜, 胺類防凍劑在犬類 (Futino et al, 2010)、兔 (Kashiwazaki et al, 2006)、羊 (Moustacas et al, 2011)、豬 (Bianchi et al, 2008)、馬 (Juliani & Henry, 2008)的精子冷凍保存中作過研究, 但未見到有關(guān)胺類防凍劑在靈長類動(dòng)物精子保存中的研究報(bào)道。比較四種不同濃度(0.2、0.4、0.8和1.2 mol/L)的胺類防凍劑(二甲基甲酰胺、甲酰胺、二甲乙酰胺、乙酰胺)對樹鼩精子冷凍存活率的影響, 結(jié)果表明, 最佳的胺類防凍劑為0.8 mol/L DF, 其冷凍精子運(yùn)動(dòng)度和頂體完整率與0.4 mol/L DMSO沒有差異, 因此, 0.8 mol/L DF可以替代0.4 mol/L DMSO作為滲透性防凍劑用于樹鼩精子冷凍保存。事實(shí)上, 運(yùn)動(dòng)度和頂體完整率并不是評估冷凍復(fù)蘇精子功能的最有說服力的指標(biāo),而精子受精能力才是衡量精子冷凍是否成功的關(guān)鍵性指標(biāo)。然而, 具有完整頂體且能運(yùn)動(dòng)的精子是人工授精過程中能夠受精的必須條件。在哺乳動(dòng)物中, 許多物種可以利用冷凍精子人工授精產(chǎn)生后代(Gabriel Sanchez-Partida et al, 2000; De Graaf et al, 2010; Underwood et al , 2010), 但是, 冷凍精子受精率和受孕率可能與精子及雌性動(dòng)物受孕能力有關(guān),如精子冷凍-解凍方法 (O'Meara et al, 2005)、誘導(dǎo)發(fā)情同步化的方法、發(fā)情的檢測、受精時(shí)間等 (Anel et al, 2005)。本研究從雌性動(dòng)物輸卵管中獲取并計(jì)數(shù)超排的卵和已經(jīng)分裂成2-細(xì)胞的胚胎, 以受精率來評估冷凍精子的受精能力而不是受孕率。在前期實(shí)驗(yàn)中, 我們證明了0.4 mol/L DMSO冷凍精子具有受精能力。因此, 我們比較0.8 mol/L DF 和0.4 mol/L DMSO冷凍精子的受精率。在本研究中, 我們可以從每只雌性動(dòng)物中獲取2～5枚卵或胚胎, 這與Cao et al (2001) 的報(bào)道一致。0.8 mol/L DF和0.4 mol/L DMSO冷凍精液受精率分別為16.7%和50%。DF凍精受精能力低下的原因可能是其凍精在移植后存活的時(shí)間短或精子內(nèi)部殘存的DF對樹鼩受精能力有所影響, 具體原因還有待進(jìn)一步研究。由此推測, 從人工受精率方面來說, 0.8 mol/L DF應(yīng)于樹鼩精子的冷凍保存還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述, 含卵黃的非離子冷凍稀釋液可能更有利于樹鼩精子冷凍保存, 但單胺類防凍劑的防凍效果還有待進(jìn)一步證實(shí)。

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Effects of some extenders and monoamines on sperm cryopreservation in tree shrews (Tupaia belangeri)

PING Shu-Huang, WANG Cai-Yun, TANG Wen-Ru, LUO Ying, YANG Shi-Hua

(Laboratory of Molecular Genetics of Aging and Tumor, Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The tree shrew may be an important experimental animal for disease models in humans. The effects of some extenders and momamines on sperm cryopreservation will provide helpful data for experimentation of strains and conservation of genetic resources in tree shrews. Epididymal sperm were surgically harvested from male tree shrews captured around Kunming, China and sperm motility, acrosome integrity and fertility were assessed during cryopreservation. In Experiment 1 eight extenders (TTE, TCG, TCF, TTG, BWW, BTS, DM, and SR) supplemented with 0.4 mol/L DMSO were used to dilute the sperm: only TTE, DM and SR showed no differences in motility and acrosome integrity compared to fresh controls after equilibration. After freezing and thawing, sperm in any extender showed lower motility than fresh control and sperm in DM showed higher motility than other groups. However, BWW produced the lowest motility. For acrosome intergrity, TTE and DM showed higher than BWW, BTS and SR after equilibration. The parameter in DM was higher than other groups (except TTE) after thawing. In Experiment 2 four penetrating cryoprotectant agents (CPA) [dimethyl-formamide (DF), formamide (F), dimethylacetamide (DA), and acetamide (A)] at 0.2 mol/L, 0.4 mol/L, 0.8 mol/L, and 1.2 mol/L, respectively were added to the DM extender. Motility showed no difference among CPA groups and non-CPA group (control) after equilibration, but all thawed sperm showed lower values in motility and acrosome intergrity than pre-freezing groups. However, sperm in 0.8 mol/L DF and 0.4 mol/LDMSO showed higher values in both parameters than that in other CPA groups (P＞0.05). In Experiment 3 the fertilization rate of oocytes inseminated with 0.4mol/L DMSO (50%) were higher than that with 0.8mol/L DF (16%). In conclusion, non-ion extenders supplemented with egg yolk may be better for sperm cryopreservation in tree shrews and cryoprotectant effects of monoamines agents should be further studied in this species.

Tree shrew; Sperm cryopreservation; Extender; Monoamines

Q954.43; Q959.832; Q492

A

0254-5853-(2012)01-0019-10

10.3724/SP.J.1141.2012.01019

2011-11-01；接受日期：2011-12-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071279, 31040055);云南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(2011CI009)資助

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: huashiyang@hotmail.com