輪狀病毒VP 7 -U 基因在胡蘿卜中表達(dá)的免疫原性分析

劉滿杏，李 霞，劉榮堂，楊 慧，趙 麗，李 鵬

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097）

腹瀉是一類危害人類健康的嚴(yán)重傳染病，約50%的嬰幼兒秋冬季腹瀉是由輪狀病毒引起的。輪狀病毒是一種腸道病毒，屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬［1］，主要以糞-口途徑傳染，在人類手上能存活數(shù)小時(shí)，而在無生命表面能存活數(shù)天，并能抵抗一般消毒劑［2］。在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家輪狀病毒的發(fā)病差別不大，不太可能通過改善環(huán)境衛(wèi)生和營(yíng)養(yǎng)狀況使之降低［3］。輪狀病毒二十面體，帶有3層結(jié)構(gòu)的衣殼蛋白，外層包括VP4和VP7［1］，內(nèi)層是VP6，核心層是VP1、VP2和VP3。目前缺乏治療性藥物，口服補(bǔ)藥是首選的治療方法。VP7蛋白占病毒粒的30%［4］，是病毒的主要外殼糖蛋白，決定病毒的血清型，并可誘導(dǎo)中和抗體，是輪狀病毒基因工程疫苗研究的首選。因?yàn)閂P7基因是輪狀病毒的一個(gè)亞基，因此不會(huì)對(duì)人體造成過度刺激，理論上不會(huì)產(chǎn)生致病反應(yīng)。在轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生產(chǎn)和傳輸方面，植物作為生物反應(yīng)器的潛力是巨大的，但是轉(zhuǎn)基因植物目的抗原的表達(dá)量有待于進(jìn)一步提高。到目前為止，已轉(zhuǎn)化口服疫苗成功的植物有煙草（Nic-otianatabacum）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、番茄（Lycopersiconesculentum）、香蕉（Musaparadisiaca）、萵苣（Lactucasativa）、羽扇豆（Lupinus polyphyllus）、菠菜（Spinaciaoleracea）、玉米（Zea mays）、苜蓿（Medicagosativa）等。煙草易于轉(zhuǎn)化和繁殖，但其組織中含有大量的生物堿。馬鈴薯也容易轉(zhuǎn)化，但人們一般只吃熟馬鈴薯。利用可直接生食的植物是未來生產(chǎn)口服疫苗的必然趨勢(shì)，胡蘿卜（Daucuscarota）可生食，易運(yùn)輸，耐儲(chǔ)存及蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)使其不可避免地成為植物受體系統(tǒng)的理想選擇［5］。

胡蘿卜是一種兩年生草本植物，傘形科胡蘿卜屬，其營(yíng)養(yǎng)豐富，被稱為健康的功能食品。轉(zhuǎn)基因胡蘿卜不管從營(yíng)養(yǎng)上還是外形上都與正常胡蘿卜差異不大。目前，有人利用轉(zhuǎn)基因胡蘿卜表達(dá)肺結(jié)核疫苗［6］，鄭回勇等［7］將人乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜，為其添加新的營(yíng)養(yǎng)保健因子，同時(shí)對(duì)增強(qiáng)植株抗性具有重要意義。根據(jù)VP7-U基因在植物表達(dá)中的需求，優(yōu)化部分VP7基因的密碼子，期望能夠增加VP7蛋白在植物中的表達(dá)量。本研究將VP7-U基因轉(zhuǎn)化到胡蘿卜中，檢測(cè)VP7-U基因在轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中的表達(dá)及其免疫原性。

1 材料與方法

1.1 材料VP7-U基因表達(dá)載體，由中國(guó)科學(xué)院微生物所構(gòu)建；VP7-U胡蘿卜種子和黑田五寸種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；BALB／c小鼠購自中國(guó)農(nóng)科院動(dòng)物中心。

Tag酶購自天根生化和全式金公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自promega和全式金公司，蛋白Maker購自MBI和天根生化公司，弗氏佐劑構(gòu)自Sigma公司，羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP分別購自博士德公司和中杉金橋公司。小牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購自天根生化公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自天根生化公司。PCR引物由奧科生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 胡蘿卜陽性植株的種植 種植VP7-U胡蘿卜傳代種子，對(duì)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜植株進(jìn)行傳代，在胡蘿卜植株10cm左右時(shí)，取新鮮胡蘿卜葉子提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步篩選培育VP7-U胡蘿卜陽性植株。

1.2.2 PCR引物擴(kuò)增 VP7-U正向引物：AGGATCTATGGACACTG，反 向 引 物：ATTAGATCCACCAACTTG；在25μL體系中，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5mmol·L-1）1.0μL，引 物 （0.01 mmol·L-1）各0.5μL，模板 DNA 1μg，Tag酶（2.5 U）0.8μL，補(bǔ)雙蒸水至25μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s、50℃退火60s、72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

1.2.3 轉(zhuǎn)VP7-U基因胡蘿卜的Western Blot

轉(zhuǎn)基因胡蘿卜蛋白的提?。喝⌒迈r的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜根0.4g，用液氮冷凍研磨成粉末，加入200μL蛋白提取緩沖液，2～3h樣品充分溶解后，4℃，12 000r·min-1，離心20min。取上清液備用。

SDS-PAGE和蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)?。河?%的SDS-聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠，20mA，2h。待蛋白Maker完全分離后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。醋酸纖維素膜，伯樂電轉(zhuǎn)儀60V，3h轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用3%BSA封閉，4℃過夜，PBST洗滌3次后加入一抗室溫孵育2h，再次洗滌3次后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗孵育2h，洗滌后用DAB顯色液染色。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中VP7-U蛋白免疫原性及濃度的檢測(cè) 以輪狀病毒VP7基因蛋白為陽性并按一定配比稀釋，以黑田五寸為陰性對(duì)照，樣品胡蘿卜蛋白以1／50倍比稀釋，每個(gè)濃度做3次平行，3%BSA封閉，一抗用兔抗VP7血清，二抗用辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔血清，酶聯(lián)反應(yīng)后洗滌，DAB顯色后加入1mol·L-1的鹽酸終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀在A450nm，A655nm讀取數(shù)值。根據(jù)VP7陽性蛋白稀釋比做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定胡蘿卜蛋白中目的蛋白的含量，并計(jì)算出所占胡蘿卜總蛋白的比例。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因胡蘿卜目的蛋白抗原性的檢測(cè)

免疫小鼠：利用提取的胡蘿卜蛋白灌服4周齡的小鼠，4只為一組。目的蛋白量20～30mg，同時(shí)保證陰性蛋白和陽性蛋白的總蛋白量相同，免疫周期為1周。免疫4次后7d采血，3 000r·min-1，10min，4℃離心，取血清，ELISA方法檢測(cè)不同小鼠體內(nèi)的IgG含量，并計(jì)算出每組小鼠的OD值平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 pBI121S.P.VP7-U構(gòu)建圖 其啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子，VP7基因前有一段煙草S.P（圖1）。

圖1 pBI121S.P.VP7 -U 構(gòu)建圖Fig.1 Construction for pBI121S.P.VP7-U

2.2 PCR 利用特異性引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果可以擴(kuò)增出621bp的目的片段（圖2）。

2.3 Western Blot 由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果可以明顯地看出37KD處的目的蛋白條帶，說明目的基因在蛋白水平上有表達(dá)（圖3）。轉(zhuǎn)膜后利用兔抗VP7為一抗（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所贈(zèng)），山羊抗兔-HRP為二抗孵育，DAB染色后可明顯看到37KD處的目的蛋白印記，進(jìn)一步說明優(yōu)化后的VP7基因在蛋白水平上得到表達(dá)（圖4）。

圖2 部分轉(zhuǎn)VP7 -U 基因胡蘿卜株P(guān)CR結(jié)果Fig.2 PCR detection of carrots transformed VP7 -U gene

圖3 8%SDS-PAGE分離胡蘿卜根部蛋白結(jié)果Fig.3 Detection of carrot root protein with 8%SDS-PAGE

圖4 胡蘿卜根部蛋白的轉(zhuǎn)膜結(jié)果Fig.4 Analysis of protein in carrot root with Western Blot

2.4 目的基因在轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中的表達(dá)量比較轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的測(cè)定結(jié)果，轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的OD值明顯高于陰性對(duì)照，說明轉(zhuǎn)基因胡蘿卜蛋白中含有免疫活性的抗原蛋白（圖5）。以細(xì)菌陽性蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各個(gè)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中的抗原含量，選取最高OD值的植株為灌服材料，并根據(jù)BCA試劑盒得出該植株可溶性總蛋白的含量，確定小鼠的灌服量，同時(shí)計(jì)算出該植株所含目的抗原在其可溶性總蛋白中的比例（表1）。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)VP7-U基因胡蘿卜與轉(zhuǎn)VP7基因胡蘿卜6株，通過ELISA檢測(cè)后分別得出OD值平均值，并與陰性對(duì)照比較，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)VP7-U基因胡蘿卜的活性抗原蛋白含量要高于轉(zhuǎn)VP7基因的胡蘿卜（圖6）。

圖5 ELISA檢測(cè)活性目的抗原結(jié)果Fig.5 Detection of active antigen with ELISA

表1 喂服小鼠的抗原量及胡蘿卜蛋白總量Table 1 Amount of antigen and carrot total protein given to mice

2.5 灌服不同蛋白的小鼠體內(nèi)的IgG比較結(jié)果表明，灌服陽性胡蘿卜蛋白的IgG高于未灌服和灌服陰性胡蘿卜蛋白的兩組（圖7）。

3 討論

輪狀病毒導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉，目前還沒有可有效治療的藥物。疫苗預(yù)防接種是遏制輪狀病毒腹瀉唯一的有效手段，而轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗是一種非常有前景的新型疫苗?？诜呙绲竭_(dá)腸內(nèi)粘膜誘導(dǎo)部位之前要經(jīng)過胃腸內(nèi)的不利環(huán)境，所以必須要受到保護(hù)，否則會(huì)失去免疫性［8］。而植物細(xì)胞壁作為天然的生物膠囊，可使細(xì)胞中的疫苗抗原通過胃內(nèi)的不利環(huán)境時(shí)受到細(xì)胞壁的保護(hù)，直接到達(dá)腸內(nèi)黏膜誘導(dǎo)部位，誘導(dǎo)黏膜和全身免疫反應(yīng)。不僅如此，轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗還可誘導(dǎo)消化道相關(guān)淋巴樣組織（GALT）產(chǎn)生分泌性的IgA（sIgA），在病原體和宿主之間相互作用的起始部位直接誘發(fā)免疫反應(yīng)，從而大大提高其免疫有效性［9］。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)出來的口服疫苗要經(jīng)過動(dòng)物和人體試驗(yàn)，以驗(yàn)證其能否引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，一般先要經(jīng)過小鼠試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中將轉(zhuǎn)基因植物提取液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃或提取轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的抗原注射小鼠［10-12］，檢驗(yàn)小鼠血清中是否存在抗體。

圖6 轉(zhuǎn)VP7 基因和VP7 -U 基因胡蘿卜的ELISA結(jié)果Fig.6 ELISA detection to carrots transformed VP7 gene and VP7 -U gene

圖7 灌服不同蛋白的小鼠體內(nèi)的IgG平均含量比較Fig.7 Comparison of IgG in different mice gave different proteins

本研究以胡蘿卜為植物受體，整合優(yōu)化的人源輪狀病毒VP7基因，經(jīng)過PCR初步檢測(cè)，Western blot和ELISA蛋白水平上的檢測(cè)后［13］，將有蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜提取液灌服4周齡小鼠，結(jié)果表明，灌服VP7陽性細(xì)菌蛋白的4只小鼠中有3只的IgG明顯高于灌服陰性胡蘿卜蛋白的小鼠；灌服陽性胡蘿卜蛋白的3只小鼠中，兩只小鼠的IgG明顯高于灌服陰性胡蘿卜的小鼠，比灌服陽性細(xì)菌蛋白的小鼠的IgG含量低，但陽性小鼠同陰性小鼠體內(nèi)的IgG含量差異不顯著。其原因除了小鼠個(gè)體差異，還可能是因?yàn)殛栃约?xì)菌蛋白的純度較高，而所用的灌服蛋白是提取的胡蘿卜粗蛋白，存在一定量的雜蛋白，同時(shí)胡蘿卜蛋白中部分雜蛋白的分子量和蛋白結(jié)構(gòu)可能與抗原蛋白相近，減少了抗原蛋白在胡蘿卜可溶性蛋白中的相對(duì)含量。由于細(xì)菌蛋白制備成口服疫苗還需要復(fù)雜的后加工過程，并且不能在室溫下保存，運(yùn)輸利用也需要一定的條件；而轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中的抗原由于胡蘿卜生物系統(tǒng)的保護(hù)，相較于細(xì)菌來說可長(zhǎng)期具有生物活性，并且耐儲(chǔ)存、易運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)凸顯了轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的優(yōu)勢(shì)。本研究用ELISA法檢測(cè)插入胡蘿卜中優(yōu)化的VP7蛋白同時(shí)得出其濃度，結(jié)果表明，優(yōu)化后的VP7蛋白在可溶性蛋白中的比例要高于正常的VP7蛋白所占的比例，在一定程度上提高了抗原量。雖然轉(zhuǎn)基因胡蘿卜口服疫苗制作還有很多問題和困難，但隨著研究的不斷深入，通過生食一根胡蘿卜而預(yù)防輪狀病毒的構(gòu)想在不久的將來終會(huì)實(shí)現(xiàn)。

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