切花百合雜種胚搶救方法

栗艷齡，梁建萍，羅鳳霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學信息學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；3.金陵科技學院園藝學院，江蘇南京210038）

百合是百合屬（Lilium）植物的總稱，花型優(yōu)美，花色豐富，為世界4 大切花之一。廣泛用于切花栽培的品系主要有：東方百合雜種系（Oriental Lily Hybirds）、亞洲百合雜種系（Asiatic Lily Hybirds）和麝香百合雜種系（Longiflorm Lily Hybrids）[1-3]。

隨著市場需求的增加，新品種選育工作受到了重視。歐美國家對百合雜交育種技術(shù)研究得比較深入，培育出了OA（東方百合×亞洲百合）、OT（東方百合×喇叭百合）、LA（麝香百合×亞洲百合）、LO（麝香百合×東方百合）等新的雜交類型，普遍認為，柱頭切割、離體胚珠授粉、子房切片培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、雜交幼胚離體培養(yǎng)等技術(shù)是目前克服受精前后障礙較有效的方法[4-6]。我國百合育種工作起步較晚，缺乏核心技術(shù)，主要依靠進口百合種球進行切花生產(chǎn)。

本試驗采用子房切片培養(yǎng)、帶胎座胚珠培養(yǎng)、胚培養(yǎng)系統(tǒng)研究栽培品種百合系內(nèi)、系間適宜的胚搶救方法，主要探討不同雜交組合基因型、不同胚齡敗育胚的培養(yǎng)方法、不同培養(yǎng)條件等因素對胚搶救效果的影響，以期為我國百合育種研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為東方百合雜種系（O）、亞洲百合雜種系（A）和麝香百合雜種系（L）的部分品種，并配置不同的系內(nèi)和系間雜交組合（表1），由金陵科技學院園藝學院提供。

表1 系內(nèi)、系間雜交組合

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法選擇 取系間雜交授粉后一定天數(shù)子房，在無菌條件下，用70%酒精進行表面消毒1 min，再用0.1%升汞消毒10～15 min，然后用無菌水沖洗3 次，采用3 種胚搶救方法——子房切片培養(yǎng)、帶胎座胚珠培養(yǎng)、胚培養(yǎng)。子房切片培養(yǎng)和帶胎座胚珠培養(yǎng)都是在授粉8～15 d后進行，其中，子房切片培養(yǎng)是將子房橫切成8 片左右，厚度為1～2 mm[7-8]，放于子房切片培養(yǎng)基上；帶胎座胚珠培養(yǎng)是從子房中切除帶胎座胚珠放在帶胎座胚珠培養(yǎng)基上，隨后二者均在授粉40～70 d 將萌發(fā)胚珠單獨切除，轉(zhuǎn)入胚珠培養(yǎng)基[9]，成苗后擴繁。胚培養(yǎng)是在授粉40～70 d進行，在超凈工作臺內(nèi)，子房經(jīng)表面消毒后橫切取出有胚種子，用尖鑷子撕去種皮，在胚乳上輕輕劃一下，擠出白色透明狀幼胚接種到胚培養(yǎng)基[10]上進行培養(yǎng)。每日對胚珠萌發(fā)數(shù)量進行記錄。不同培養(yǎng)方法培養(yǎng)基配制如表2 所示。

表2 不同培養(yǎng)基類型的配制方法

子房切片和帶胎座胚珠培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度50%～60%。胚培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度50%～60%，光強2 000～3 000 lx，光照/黑暗為16 h/8 h。

1.2.2 適宜培養(yǎng)基選擇 取系內(nèi)雜交授粉后有胚蒴果，以MS 為基本培養(yǎng)基，即蔗糖30 g/L，瓊脂6.0 g/L，pH 值為5.8，附加不同質(zhì)量濃度生長素NAA、細胞分裂素6-BA，篩選最適培養(yǎng)基（表3）。培養(yǎng)條件同胚培養(yǎng)。

1.2.3 不同雜交組合適宜培養(yǎng)時期選擇 選取系內(nèi)授粉后30，40，50 d 的百合蒴果，消毒（方法同1.2.1）后接種在胚培養(yǎng)培養(yǎng)基上，每組合選取20 個長勢好的胚接種，調(diào)查萌發(fā)率、成苗率，且比較不同接種時期的差異，確定最適培養(yǎng)時期。

表3 胚培養(yǎng)基配方設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同胚搶救方法對系間雜交受精后的影響

2.1.1 子房切片培養(yǎng)的影響 在子房切片培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)LA 雜交型中的白天堂×頂級組合和OA 雜交型中的索蚌×頂級組合子房切片培養(yǎng)1 周后，部分切片生長良好，子房壁綠色，胚珠明顯膨大，由綠色變?yōu)榘咨▓D1-A），也有部分胚珠變白后切片出現(xiàn)褐化現(xiàn)象（圖1-B）；隨時觀察發(fā)現(xiàn)，胚珠上陸續(xù)有微小突起，表明胚珠開始萌發(fā)，將萌發(fā)胚珠切除進行單獨培養(yǎng)，最終僅有1 枚胚珠能萌發(fā)（圖1-C、表4）。OA 型中的西伯利亞×多安娜、OL 型中的索蚌×白天堂、AO 型中的多安娜×索蚌及LO 型組合在子房切片培養(yǎng)過程中，胚珠幾乎不膨大，隨子房壁褐化（圖1-D）無法切離胚珠。其余雜交組合部分子房切片培養(yǎng)正常，但膨大的子房一直未萌發(fā)，其中，西伯利亞×多安娜、白天堂×西伯利亞正交組合胚珠無法切除，試驗不能繼續(xù)；而反交中膨大胚珠切離后則不能萌發(fā)。陳軍營等[11]報道，核與質(zhì)的互作不同，造成正、反交組合中正、反交之間差異較大。

表4 子房切片培養(yǎng)的萌發(fā)情況

2.1.2 帶胎座胚珠培養(yǎng)的影響 帶胎座胚珠培養(yǎng)的萌發(fā)情況如表5 所示。

表5 帶胎座胚珠培養(yǎng)的萌發(fā)情況

由表5 可知，OA 雜交型索蚌×頂級組合有2 個胚珠萌發(fā)，LA 雜交型白天堂×頂級組合有1 個胚珠萌發(fā)，比子房切片培養(yǎng)中胚珠膨大切離數(shù)量多，且胚珠萌發(fā)時間提前；OA 雜交型西伯利亞×多安娜和LO 雜交型白天堂×西伯利亞組合都克服了在子房切片培養(yǎng)中胚珠不膨大不能進行胚珠切離的現(xiàn)象，可見，本試驗中帶胎座胚珠培養(yǎng)相對優(yōu)于子房切片培養(yǎng)。但是，采用此方法的OL，AO，AL 雜交型組合仍沒有胚珠萌發(fā)，周國強[12]以亞洲百合為母本、東方百合為父本的研究結(jié)果表明，能得到果實，但獲得的雜種胚也不萌發(fā)。說明以亞洲百合為母本的雜交組合基因型差異較大，存在著嚴重的受精障礙。

2.1.3 胚培養(yǎng)的影響 對不同雜交型組合適時進行胚培養(yǎng)，僅在OA，LA，LO 雜交型中剝離出胚（表6）。OA 雜交型中索邦×頂級組合胚萌發(fā)時間相對提前，胚萌發(fā)比例高；LA 雜交型素雅×多安娜和LO 雜交型白天堂×西伯利亞組合都有胚萌發(fā)，克服了子房切片培養(yǎng)和帶胎座胚珠培養(yǎng)胚珠不萌發(fā)現(xiàn)象。另外，胚培養(yǎng)沒有使LA 雜交型白天堂×頂級組合胚萌發(fā)，僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)胚珠中存在無胚僅有胚乳的現(xiàn)象，說明在培養(yǎng)過程中，某培養(yǎng)條件不合適引起了胚敗育，這還有待進一步探討。

表6 胚培養(yǎng)情況

2.2 不同激素配比對百合雜種胚培養(yǎng)的影響

由表7 可知，LL 型雪皇后×白天堂的雜種胚在僅添加有0.01 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，且隨著6-BA 質(zhì)量濃度增加，萌發(fā)率下降；LL 型素雅×白天堂和AA 型多安娜×普瑞頭的雜種胚在0.1 mg/L NAA＋0.05 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，說明對激素有一定要求，且需要少量6-BA 與NAA 共同發(fā)揮作用；OO型雜交組合和AA 型普瑞頭×索萊爾的雜種胚在僅添加0.1 mg/L NAA 培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，且在不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基上根本不萌發(fā)?？梢姡煌s交基因型組合對激素質(zhì)量濃度及配比要求是不一樣的。

2.3 不同胚齡對百合雜種胚培養(yǎng)的影響

由表8 可知，OO 型雜交系列在授粉后50 d剝胚較合適，AA，LL 型雜交系列在授粉后40 d左右剝胚較適宜；且同一雜交型不同組合相同胚齡萌發(fā)率不同，如索蚌×西伯利亞30 d 胚齡雜種胚萌發(fā)率為20%，索蚌×卡薩布蘭卡萌發(fā)率為0。為此，不同雜交基因型組合，胚搶救時間不一致。

表7 不同培養(yǎng)基上不同組合胚萌發(fā)情況

表8 不同胚培養(yǎng)時間不同組合胚萌發(fā)情況

3 結(jié)論與討論

本試驗采用子房切片培養(yǎng)和帶胎座胚珠培養(yǎng)使OA，LA 型雜種胚萌發(fā)，且?guī)プ咧榕囵B(yǎng)方法相對優(yōu)于子房切片培養(yǎng)方法，但2 種培養(yǎng)方法獲得的雜種苗在后期生長過程中逐漸褐化死亡或者產(chǎn)生愈傷組織后由綠變白死亡；據(jù)報道在授粉后5 d 就能進行子房切片和帶胎座胚珠培養(yǎng)[8，13]，且雜交組合不同，具體的合適胚齡也不同[14]，推測胚齡選取不合適，導致萌發(fā)組合極少，萌發(fā)率極低；采用胚培養(yǎng)使OA，LA，LO 型雜種胚萌發(fā)，且LA 型中獲得雜種胚的雜交組合與前2 種方法不一致，后期僅獲得LA 型素雅×多安娜組合中1 株雜種苗，其余組合胚萌發(fā)后沒有成苗或逐漸褐化死亡，說明種間不親和性一直延續(xù)到雜種苗生長過程中，還需要對雜種后代成苗過程進一步研究。另外，3 種方法均能使OA 型索邦×頂級組合雜種胚萌發(fā)，且萌發(fā)率遞增，說明對于親和性較好雜交組合，胚培養(yǎng)有效性要高于其余2 種培養(yǎng)方法。

關(guān)于胚搶救技術(shù)問題，國內(nèi)大多采用幼胚培養(yǎng)，國外對胚培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、心皮培養(yǎng)進行了廣泛研究，實際上這4 種方法是對不同胚齡的胚進行研究。Chi[9]認為，子房切片培養(yǎng)比單胚珠培養(yǎng)、帶胎座胚珠培養(yǎng)效果好，且4 種方法均沒有使以亞洲百合為母本的AO，AL 型雜種胚萌發(fā)；焦雪輝等[15]也證實了以亞洲百合為母本，東方百合為父本是不親和的。本試驗認為，對于親和性小的組合，采用帶胎座胚珠培養(yǎng)比子房切片培養(yǎng)效果好，對于親和性大的組合，仍然要采用幼胚培養(yǎng)，但要注意培養(yǎng)條件。Fernandez 等[13]研究表明，子房切片培養(yǎng)時間大大影響了植株苗再生。本試驗中萌發(fā)的胚幾乎沒有成苗，可能與胚珠從子房切片或胎座中一個個轉(zhuǎn)移到胚珠培養(yǎng)基上耗時有關(guān)；也有人報道，胚珠可直接在胎座或切片中萌發(fā)，可見，后期雜種苗再生也是不親和性研究的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本試驗發(fā)現(xiàn)，胚齡和激素配比對胚培養(yǎng)的萌發(fā)率有一定影響。對于OO 型雜交組合，50 d 左右胚齡適宜培養(yǎng)，對生長素要求較高；對于AA，LL 型雜交組合，40 d 左右胚齡適宜培養(yǎng)，且不同雜交組合對激素配比要求不一。多數(shù)研究[9，16]認為，授粉后30 d 就可以進行幼胚培養(yǎng)。本研究對索蚌×卡薩布蘭卡組合胚齡達30 d 左右的胚進行培養(yǎng)，萌發(fā)率為0，說明胚齡過小的胚培養(yǎng)成熟需要創(chuàng)造更好的培養(yǎng)條件。合理激素配比有利于胚性生長，促進胚發(fā)育成熟。前人對激素的添加比例眾說紛紜，孫曉梅等[10]研究認為，生長素和細胞分裂素最優(yōu)配比為0.001 mg/L NAA＋0.1 mg/L6-BA；王丹菲等[16]認為，0.01 mg/L NAA＋0.1 mg/L 6-BA 為較優(yōu)組合。屈云慧等[17]認為，培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的合理配比對控制幼胚胚性生長、促進胚發(fā)育成熟起決定性作用。本試驗中不同雜交組合雜種胚萌發(fā)對激素要求存在差異，0.01～0.10 mg/L NAA 的添加是必要的。為此，在百合雜交育種中，對重要雜交組合進行胚搶救時，在激素配比上應(yīng)慎重考慮。

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