氮素調(diào)節(jié)玉米幼穗及籽粒發(fā)育的生理機(jī)制

米國華，陳范駿，袁力行

(教育部植物-土壤相互作用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193)

玉米是全球最重要的多用途作物之一，廣泛應(yīng)用于糧食、飼料、化工、生物能源等行業(yè)，因此國內(nèi)外需求與價(jià)格不斷攀升。我國玉米高產(chǎn)育種已取得了重大成就，超高產(chǎn)記錄不斷突破。2005 年，山東李登海育種試范田的夏播玉米產(chǎn)量記錄已經(jīng)達(dá)到21.05 t·hm-2。然而，不容忽視的是，目前的高產(chǎn)記錄都是高肥高水條件下獲得，我國農(nóng)田氮肥投入量大、氮肥利用率低，是基本公認(rèn)的事實(shí)。20 世紀(jì)80 年代以來，我國化肥用量持續(xù)高速增長，2007 年已超過5 000 萬t，占全球消費(fèi)總量的35%。每年僅損失的氮肥就在500 萬t 以上。據(jù)FAO (2005)的數(shù)據(jù)，在相近的施肥量條件下我國的平均氮效率(氮肥偏生產(chǎn)力)比美國低15 個(gè)百分點(diǎn)。據(jù)閆麗珍等研究結(jié)果，我國玉米生產(chǎn)中的可變成本中，化肥費(fèi)用最高(占總成本的40%～50%)，其次分別為種子、動(dòng)力、排灌、畜力、農(nóng)家肥等。過量的氮肥除了增加農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)成本，還對環(huán)境造成巨大壓力［1］。為了減輕過量氮量對環(huán)境污染的壓力，美國和歐盟各國都制定了農(nóng)田氮肥投入量的限制性條款。因此，如何在適當(dāng)降低施肥量的前提下達(dá)到高產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)高效，已成為國家的重大需求。其中蘊(yùn)含的科學(xué)理論問題，需要深入研究。

在科學(xué)施肥的前提下，選用高效吸收利用氮素的氮高效品種，是在適當(dāng)降低施氮量的條件下維持較高產(chǎn)量水平的重要途徑之一［2］。國內(nèi)外有關(guān)氮高效生理、遺傳基礎(chǔ)研究方面已經(jīng)開展了多年的工作，在氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆與功能分析［3］、氮素調(diào)節(jié)根系發(fā)育［4-5］、氮素誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜［6］、氮高效性狀QTLs 定位等方面都取得了重要進(jìn)展［2，7］。然而這些研究多集中于苗期或短期效應(yīng)，很少涉及到作物產(chǎn)量器官的形成。而在田間水平上，氮高效的重要性狀之一產(chǎn)量器官的性狀。以玉米為例，田間供氮不足造成減產(chǎn)的最主要原因的是穗發(fā)育不良，穗粒數(shù)下降，見圖1。深入研究氮素調(diào)節(jié)玉米幼穗及籽粒發(fā)育的控制機(jī)制，確定關(guān)鍵的生理與生化過程，對于選育氮高效玉米品種具有重要指導(dǎo)意義。

圖1 低氮脅迫對玉米穗發(fā)育的影響Fig.1 Effect of nitrogen (N)deficiency on earshoot and grain development in maize

1 氮素對玉米幼穗及籽粒發(fā)育的影響

玉米的雄穗、雌穗同株，是典型的異花授粉作物。雄穗著生于莖稈頂部，雌穗由葉腋的腋芽發(fā)育而成，是變態(tài)的側(cè)枝。雌穗的抽出(抽絲，即開花)比雄穗抽出(抽雄)稍晚。抽絲順序?yàn)?靠近穗基部1/3 處的花絲先抽，而后向上、向下陸續(xù)抽絲，頂部花絲抽出最晚。不良的環(huán)境條件下，如干旱、缺肥等，對雌穗的抑制作用大于雄穗，使抽雄-吐絲間隔期(ASI)延長，容易造成雌、雄穗花期不遇，花絲受精不良，最終形成禿尖(頂部籽粒敗育)，甚至空稈(所有籽粒不結(jié)實(shí))。雌穗小花授粉后3 d～16 d 內(nèi)是胚建成及胚乳細(xì)胞分裂期，其后進(jìn)入籽粒灌漿期，授粉后50 d～55 d，籽粒成熟［8］。因此，抽絲前1 周至抽絲后2 周這段時(shí)間，雖然幼穗及籽粒的干物質(zhì)量很小，卻是決定玉米籽粒數(shù)及籽粒大小的關(guān)鍵時(shí)期［9-10］。

氮素供應(yīng)不足對玉米幼穗及籽粒發(fā)育有強(qiáng)烈的影響。玉米苗期需氮量少，而普通農(nóng)田土壤及基施氮肥能滿足氮素前期需求，所以氮素一般不至缺乏。至抽雄開花期左右時(shí)，由于植株生長量較大、土壤氮素耗歇很快，常達(dá)到4 kg N·d-1·hm-2～5 kg N·d-1·hm-2［11］。追肥量不足的條件下，此時(shí)極易出現(xiàn)缺氮。研究表明，此時(shí)輕度低氮脅迫對營養(yǎng)體生物量影響很小，從外觀不易察覺，但卻導(dǎo)致穗頂部籽粒敗育和結(jié)實(shí)率下降［11-12］。中度及嚴(yán)重缺氮條件下，雌穗發(fā)育及抽絲嚴(yán)重受阻，開花-吐絲期間隔時(shí)間加長，表現(xiàn)為空桿率顯著增加(有效穗數(shù)減少)，穗長及穗粒數(shù)顯著降低［11，13-14］。不同基因型幼穗及粒粒發(fā)育對低氮脅迫的敏感性不同，氮高效基因型的穗粒發(fā)育顯著優(yōu)于氮低效基因型，表現(xiàn)為結(jié)實(shí)率、穗粒數(shù)和單穗質(zhì)量顯著較高［15-16］。

2 氮素調(diào)節(jié)玉米幼穗及籽粒發(fā)育的生理機(jī)制:谷氨酰胺合成酶(GS)的重要性

氮素明顯影響幼穗及籽粒發(fā)育，但其中的生理學(xué)機(jī)制尚不很清楚。缺氮條件下植株積累大量糖分，這些糖分進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為花青素等次生代謝產(chǎn)物。因此，碳的供應(yīng)不太可能成為幼穗及籽粒發(fā)育的初級限制因素。缺氮對授粉后10 d 內(nèi)籽粒中的碳水化合物含量影響不大，而且碳氮比(C/N)還有所增加，也說明碳的供應(yīng)不是籽粒敗育的主要因素。同時(shí)，缺氮降低頂部籽粒的酸性轉(zhuǎn)化酶活性［17］，表明碳的利用在籽粒發(fā)育過程中起重要作用。然而，由于碳的利用受籽粒發(fā)育的調(diào)節(jié)，很難分清酸性轉(zhuǎn)化酶的變化是籽粒敗育的原因還是結(jié)果。在氮代謝方面，早期研究表明，籽粒內(nèi)部的氮代謝過程可能對籽粒的發(fā)育有直接作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)［19］，吐絲后8 d 時(shí)，低氮使玉米穗軸中的天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)含量顯著下降，其它氨基酸含量變化不顯著。但到吐絲后14 d 時(shí)，低氮與高氮處理的穗軸中所有氨基酸的含量并沒有顯著差異。穗軸中的氨基酸轉(zhuǎn)化過程(尤其是從天冬酰胺向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化)可能是反映籽粒氮素供應(yīng)狀況的一個(gè)信號，最終決定相應(yīng)部位籽粒的結(jié)實(shí)與敗育，其中谷胺酰胺合成酶(GS)可能起到關(guān)鍵作用。Martin 等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)谷胺酰胺合成酶GS1 活性對玉米籽粒發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。該酶在玉米中受5 個(gè)基因控制(Gln1 -1～Gln1 -5)，其中Gln1 -3 定位于葉肉細(xì)胞，Gln1 -4 定位于葉維管束鞘細(xì)胞。將這兩個(gè)基因分別進(jìn)行突變后，玉米籽粒數(shù)和粒質(zhì)量分別顯著降低，雙突變體籽粒數(shù)和籽質(zhì)量均嚴(yán)重下降。在抽絲期，野生型與突變體葉片中的硝酸鹽、可溶性糖以及氨基酸水平均沒有顯著差異，只是突變體中的銨水平顯著升高，但在韌皮部汁液中，突變體中除谷氨酸外的各種氨基酸濃度普遍降低。說明這兩個(gè)基因的作用可能與葉片中氨基酸的合成及其輸出有關(guān)，因而氮的輸出過程可能成為限制幼穗和(或)籽粒發(fā)育的重要因素。在玉米中超表達(dá)這兩個(gè)基因后，在高氮供應(yīng)下增加了籽粒數(shù)和籽粒產(chǎn)量(30%)，但在低氮條件下并未發(fā)現(xiàn)穗粒發(fā)育有顯著的改善［2］。由于GS 是植物氮代謝的關(guān)鍵酶，所有的氮化合物幾乎都有通過GS 的調(diào)節(jié)才能進(jìn)入氮代謝其它途徑，所以GS 突變體的結(jié)果需要謹(jǐn)慎對待，它只能說明GS 在氮代謝及植物生長發(fā)育的重要性，不一定反映低氮脅迫下作物高效利用氮素、維持籽粒正常發(fā)育的機(jī)理。在正常植株的缺氮條件下，氨基酸由葉片向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)是否是限制幼穗及籽粒發(fā)育的決定因素?GS 酶活性是否是限制葉片氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素?控制GS 酶的哪個(gè)基因起關(guān)鍵作用?尚需要深入進(jìn)一步探討。

3 細(xì)胞分裂素與氮營養(yǎng)信號傳遞

細(xì)胞分裂素是植物最重要的激素之一，其核心功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化。它參與多種植物生理與發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，如芽的形成、葉片擴(kuò)張、延遲衰老、促進(jìn)種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)根系發(fā)育等等。大量研究表明，細(xì)胞分裂素在作物穗粒發(fā)育過程中起到重要調(diào)節(jié)作用［21］。在作物胚乳建成期籽粒中細(xì)胞分裂素水平達(dá)到最高峰［22］。在玉米中已發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)穗的分化，外源細(xì)胞分裂素供應(yīng)可以促進(jìn)雌雄發(fā)育，增加玉米雌穗籽粒的數(shù)量［23］。

植物細(xì)胞分裂素合成的第一步受腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(adenosine phosphate -isopentenyltransferase，IPT)控制［24］。該酶催化由二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)和AMP (或ADP、ATP)向異戊烯基腺苷核苷單磷酸(IPRMP (N6-isopentenyl adenine riboside 5’-monophosphate)(或異戊烯基腺苷核苷二磷酸IPRDR、異戊烯基腺苷核苷三磷酸IPRTP)的轉(zhuǎn)化。在玉米中發(fā)現(xiàn)有9 個(gè)IPT 基因(已公布的美國專利)。細(xì)胞分裂素信號由His-Asp 雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(His-Asp two-component regulatory system)構(gòu)成，該系統(tǒng)包括3 個(gè)模塊:細(xì)胞分裂素感受器(組氨酸激酶，HK)、磷酸根傳遞蛋白(HP)和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(RR)。最后由響應(yīng)調(diào)節(jié)因子調(diào)控下游功能基因的表達(dá)［24］。玉米中已發(fā)現(xiàn)10 個(gè)RR 基因［25］。

根據(jù)現(xiàn)代植物生物學(xué)理論，植物對脅迫反應(yīng)的上游過程是對脅迫信號的接收與轉(zhuǎn)導(dǎo)。對氮素而言，植物可能感受兩個(gè)方面的缺氮信號，一是感受根際土壤的氮素水平信號，二是感受植株體內(nèi)養(yǎng)分狀況信號。這些信號通過長距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)特定的反應(yīng)部位，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)及相應(yīng)的生理與形態(tài)學(xué)反應(yīng)。植物激素是環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要組成部分，人們最為熟知的例子是脫落酸(ABA)傳導(dǎo)土壤水分虧缺信號。關(guān)于氮素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前了解雖然還很少，但細(xì)胞分裂素介導(dǎo)由根向地上部氮素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，已經(jīng)得到大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持［26］，表現(xiàn)為以下幾方面:

①在玉米中，根木質(zhì)部汁液中及葉片中的細(xì)胞分裂素的主要形態(tài)分別是ZR 和Z，硝酸鹽可以快速增加細(xì)胞分裂素的合成、細(xì)胞分裂素合成酶基因表達(dá)［27-28］。在擬南芥中，AtIPT3 受硝酸鹽快速誘導(dǎo)，而AtIPT5 受硝酸鹽和銨的長期誘導(dǎo)［29］。

②硝酸鹽誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素特異性響應(yīng)調(diào)節(jié)因子RR 表達(dá)。在玉米的10 個(gè)RR 基因中，ZmRR1 和Zm-RR2 受硝酸鹽供應(yīng)的誘導(dǎo)［27-28，30］。在擬南芥中ARR3～ARR7 也受硝酸鹽的特異誘導(dǎo)［31］。

③細(xì)胞分裂素參與氮素調(diào)節(jié)的植物形態(tài)建成過程。與供應(yīng)硝態(tài)氮相比，供應(yīng)銨態(tài)氮顯著抑制煙草葉片細(xì)胞分裂及擴(kuò)張，其原因并不是葉片氮含量不同，而是由根向葉片運(yùn)輸?shù)募?xì)胞分裂素下降［32］。高氮抑制玉米根的伸長與細(xì)胞分裂素水平升高密切相關(guān)［33］。

④細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)硝酸鹽吸收與硝酸還原酶活性。短期細(xì)胞分裂素處理誘導(dǎo)硝酸鹽還原酶基因表達(dá)及酶活性，這一點(diǎn)早為人知。但在細(xì)胞分裂素合成酶IPT 轉(zhuǎn)基因煙草中，內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平過高則抑制NRA 活性［34］。研究還發(fā)現(xiàn)，外源或韌皮部中的細(xì)胞分裂素供應(yīng)水平偏高，可以極大地抑制硝酸鹽吸收速率［35］。

⑤細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)葉片中氮素的輸出。最新研究發(fā)現(xiàn)，將A. Tumefaciens 的IPT 基因轉(zhuǎn)入小麥后，延遲葉片衰老的同時(shí)，也降低了葉片中15N 向穗粒的運(yùn)輸［36］。

綜合相關(guān)文獻(xiàn)，Sakakibara［25］認(rèn)為，氮素(硝酸鹽)信號具有特異性和非特異性兩種，特異性信號主要調(diào)節(jié)含氮化合物(如氨基酸、核酸等)的合成，而非特異信號則由細(xì)胞分裂素介導(dǎo)，主要調(diào)節(jié)氮化合物分配及植物發(fā)育過程，如細(xì)胞分裂與葉片衰亡及相應(yīng)物質(zhì)輸出等。

4 低氮脅迫抑制玉米穗粒發(fā)育的可能機(jī)制

綜合上述前人的研究結(jié)果，有兩個(gè)方面的問題尚不清楚:①低氮條件下葉片氮素輸出及幼穗或籽粒中氮素利用，哪一個(gè)是決定幼穗與籽粒發(fā)育的關(guān)鍵因素?氮同化關(guān)鍵酶GS 的作用機(jī)制是什么?②細(xì)胞分裂素信號途徑是否參與了氮素調(diào)節(jié)幼穗及籽粒的發(fā)育過程?如果是，是通過誘導(dǎo)葉片中氮素的輸出，還是幼穗及粒中的氮素利用?是什么部位合成的細(xì)胞分裂素起到調(diào)節(jié)作用(根或穗部)?前人的研究在這兩方面都提供了良好的線索，但現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還不能得出確定的結(jié)論。提出的假說是:在土壤缺氮條件下，缺氮信號通過細(xì)胞分裂素運(yùn)到葉部(及其它營養(yǎng)器官)，誘導(dǎo)了葉片中氮素(蛋白質(zhì))分解、由GS 參與調(diào)控的氮素代謝以及向籽粒中的轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)到雌穗軸的氮素(氨基酸)一方面提供一種氮素營養(yǎng)信號，通過籽粒細(xì)胞分裂素的合成，傳遞給籽粒，控制籽粒中胚乳細(xì)胞的發(fā)育;另一方面，通過GS 酶參與調(diào)控的氮代謝過程，直接作為養(yǎng)分被籽粒發(fā)育所利用，見圖2。氮高效利用玉米基因型可能通過細(xì)胞分裂素信號傳導(dǎo)，使葉片蛋白質(zhì)分解和(或)輸出更多，增加穗/籽粒中氮素供應(yīng)，并在穗部產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞分裂素信號，誘導(dǎo)胚乳細(xì)胞的分裂，保證更多的籽粒正常發(fā)育結(jié)實(shí)。

圖2 氮素調(diào)節(jié)玉米穗及籽粒發(fā)育的可能機(jī)理Fig.2 Possible physiological mechanism for the regulation of nitrogen availability on the development of earshoots and grains in maize

5 展 望

如何在高產(chǎn)的同時(shí)提高玉米氮素利用效率，是目前國際關(guān)注的熱點(diǎn)之一。在氮素吸收的生理與分子生物學(xué)機(jī)制方面已經(jīng)有較大的研究進(jìn)展，而在氮高效利用方面則進(jìn)展緩慢。葉片中氮素利用與轉(zhuǎn)運(yùn)、穗粒發(fā)育過程中氮素調(diào)節(jié)機(jī)制可能是關(guān)鍵的突破點(diǎn)。利用穗粒發(fā)育對低氮敏感性有差異的品種比較，在生理學(xué)分析的同時(shí)，通過基因芯片高能量分析技術(shù)，有可能發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的控制過程、甚至基因。其中，氮素營養(yǎng)與植物激素(尤其是細(xì)胞分裂素)的相互作用需要格外重視。另一方面，目前還沒有發(fā)現(xiàn)受氮素調(diào)節(jié)的控制玉米穗粒發(fā)育的相關(guān)QTL，這一方面的工作不僅有助于深入理解氮素調(diào)節(jié)玉米幼穗及籽粒發(fā)育的遺傳機(jī)制，而且還可以同時(shí)促進(jìn)氮高效利用遺傳改良工作。

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