丙戊酸對大鼠急性脊髓損傷后BDNF及NT-3表達(dá)的影響

李新枝

成都醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，四川成都 610083

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后由于神經(jīng)元無法再生以及繼發(fā)性損傷，造成運動和感覺功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，迄今為止尚無切實有效的治療方法。近年來研究表明，丙戊酸（valproic acid，VPA）具有多方面的神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)和神經(jīng)保護作用[1]，而有關(guān)VPA對SCI的影響及機制的報道很少。研究證實，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)素3（neurotrophin-3，NT-3）具有阻止神經(jīng)元死亡和促進軸突再生的雙重作用[2]。本研究通過探討VPA對大鼠SCI后BDNF和NT-3表達(dá)的影響，為臨床治療SCI提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康成年雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300 g，由成都醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。置實驗室環(huán)境中飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。

1.2 試劑

丙戊酸（購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司），兔抗大鼠BDNF一抗，兔抗大鼠NT-3一抗，SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（均購自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 脊髓損傷動物模型制作

大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。1%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，采用改良的Allen法制作脊髓損傷動物模型：大鼠俯臥位固定，無菌條件下暴露T9～11椎板，咬除T10的棘突及椎板，以12.5 mm×10 g的能量撞擊，金屬桿下落后大鼠迅速出現(xiàn)搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動，表明撞擊成功。對照組（C組）只做T10椎板切除術(shù)。

1.4 動物分組及處理

60只大鼠隨機分為損傷組（SCI組）、丙戊酸保護組（VPA組）和C組，每組又分為傷后24、48、72 h和1周4個時間點，每個時間點5只大鼠。VPA組術(shù)后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C組和SCI組在相應(yīng)時間點注射等體積的生理鹽水。術(shù)后皮下注射青霉素（10 000 U/100 g）抗感染，SCI組大鼠給予人工排尿，每日2次。

1.5 BBB評分[3]

各組大鼠于術(shù)后24、48、72 h和1周行BBB評分。為保證評分的準(zhǔn)確性，由3名非實驗人員了解評分標(biāo)準(zhǔn)后，各自評分，取平均值。

1.6 取材及樣品制備

大鼠采用1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后行灌流固定，打開胸腔暴露心臟及主動脈根部，左心室插管至主動脈根部，剪開右心耳，灌注生理鹽水約200 mL，至流出液體澄清，換用4%多聚甲醛灌注約300 mL 40min，灌流固定成功后，依次剪開動物背部皮膚、肌肉，暴露損傷段脊髓，以損傷段為中心，切取約1 cm的脊髓段，4%多聚甲醛后固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，從損傷中心連續(xù)橫切片，片厚5μm，備用。

1.7 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3檢測

切片常規(guī)脫蠟水化后，用SABC法進行免疫組織化學(xué)染色。以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。光鏡下（10×40）每張切片隨機拍攝5個不重復(fù)的視野。用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件測量BDNF及NT-3免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠BBB評分比較

C組各時間點運動功能均未受影響，評分均為21分，SCI組和VPA組的BBB評分在各時間點均顯著下降，但VPA組的評分在各時間點高于SCI組，SCI后48、72 h和1周兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BBB評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠BBB評分比較（±s，分）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù)24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 0.33±0.27*0.42±0.17*21 2.42±0.32*4.08±0.31*#21 4.50±0.43*7.67±0.54*#21 5.53±0.65*10.78±0.36*#21

2.2 三組大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3表達(dá)情況比較

C組各時間點BDNF和NT-3均有少量表達(dá)，BDNF陽性產(chǎn)物主要位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)，NT-3陽性產(chǎn)物在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見。SCI組和VPA組在傷后24 h即可見BDNF和NT-3表達(dá)明顯增加，BDNF的表達(dá)在傷后72 h達(dá)高峰，以后逐漸減少，1周時其表達(dá)水平仍明顯高于C組（P＜0.05）。NT-3的表達(dá)在傷后1周達(dá)高峰。與SCI組相比，VPA組的BDNF和NT-3陽性表達(dá)在各時間點均明顯增加（P＜0.05）。見表2、3。

表2 三組大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子平均光密度比較（±s）

表2 三組大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子平均光密度比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù)24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 118.24±11.13*167.04±8.86*#82.66±6.78 134.33±9.36*193.86±11.38*#80.24±4.53 168.35±9.27*212.76±10.04*#81.07±5.23 147.26±10.21*188.23±9.01*#82.76±6.84

表3 各組大鼠神經(jīng)營養(yǎng)素3平均吸光度比較（±s）

表3 各組大鼠神經(jīng)營養(yǎng)素3平均吸光度比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù)24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 91.08±6.32*126.49±11.38*#65.24±6.75 97.81±7.95*139.27±10.49*#62.14±5.67 102.18±8.49*149.29±11.13*#66.39±6.51 127.83±9.27*168.18±9.36*#61.83±7.21

3 討論

VPA是一種情緒穩(wěn)定劑和抗癲癇劑，常用于雙相性情緒障礙的治療。近年來VPA的神經(jīng)保護作用日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，VPA具有阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性中毒、減輕炎癥反應(yīng)、抑制脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化、抗凋亡等效應(yīng)，對帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病具有保護作用[4]。但VPA的神經(jīng)保護作用機制目前尚不完全明確。神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTFs）是機體產(chǎn)生的能支持神經(jīng)元存活和促進軸突生長的一類蛋白質(zhì)，包括神經(jīng)營養(yǎng)素家族（NGF、BDNF、NT-3等）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子家族和成纖維細(xì)胞生長因子家族。研究證實，NTFs對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育、分化和再生起重要作用，對神經(jīng)病和精神病均具有潛在治療作用[5]。

SCI后的病理生理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是指受傷即時由機械性損傷所造成的細(xì)胞壞死和出血。繼發(fā)性損傷的機制還不完全清楚，目前已知的包括缺氧、缺血-再灌注、谷氨酸興奮性中毒、氧化應(yīng)激、自由基形成和炎癥反應(yīng)等，這一系列反應(yīng)造成神經(jīng)細(xì)胞進一步的壞死和凋亡。由于SCI后損傷局部缺乏NTFs以及存在軸突生長抑制因子等因素，造成神經(jīng)細(xì)胞再生困難，因此，外源性補充NTFs或用藥物促進神經(jīng)細(xì)胞自身合成和分泌NTFs，將有助于患者神經(jīng)功能恢復(fù)。Sasaki等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞移植比單純的間充質(zhì)干細(xì)胞移植更能促進SCI后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和軸突生長，并且有助于損傷面積縮小，表明BDNF對SCI具有保護作用。Guo等[7]研究證實NT-3基因修飾的施萬細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植與單獨移植神經(jīng)干細(xì)胞相比，有更多的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。本研究VPA組的BDNF和NT-3表達(dá)與SCI組相比在各時間點均明顯增加，表明VPA可促進SCI后大鼠內(nèi)源性的BDNF和NT-3表達(dá)。與本研究相似，Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，VPA可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放NTFs，從而保護受損的多巴胺能神經(jīng)元。

本研究BBB評分顯示，VPA組的評分在各時間點均高于SCI組，兩者相比在傷后48、72 h和1周差異有顯著性（P＜0.05），表明VPA可促進SCI后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機制可能與促進BDNF和NT-3表達(dá)相關(guān)。此外，筆者前期的研究表明，VPA可減少SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，上調(diào)HSP 70表達(dá)[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，VPA通過促進內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖從而對SCI發(fā)揮保護作用。最近有研究報道，VPA可抑制組蛋白脫乙酰基酶活性[10]，從而促進SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)。有關(guān)VPA對SCI保護作用的確切機制目前還不清楚，仍需進一步研究。

綜上所述，VPA通過促進BDNF和NT-3表達(dá)，從而對SCI發(fā)揮保護作用。由于VPA具有多方面的神經(jīng)保護作用，其有望成為臨床治療SCI的備選藥物之一，因此有必要進一步深入探討其對SCI保護作用及其機制。

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