環(huán)氧化酶-1、環(huán)氧化酶-2、Fas配體在門脈高壓大鼠胃組織中的表達(dá)及意義

郭志坤 郭建昇 苗晉陽(yáng)

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，山西太原 030001

門脈高壓（PHT）是肝硬化導(dǎo)致的最常見(jiàn)也是最復(fù)雜的癥狀之一，同時(shí)也是肝硬化導(dǎo)致死亡的最主要原因。許多臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表明酒精、非甾體類抗炎藥物、缺血再灌注、胃黏膜損傷與修復(fù)都增加了胃黏膜損傷的敏感性[1-2]?，F(xiàn)在人們已經(jīng)逐漸接受了PHT導(dǎo)致局部血液量增加、外周血液循環(huán)抵抗降低而導(dǎo)致心輸出量增加，因而被稱之為高動(dòng)力循環(huán)的觀點(diǎn)[3-5]。胃黏膜的機(jī)能障礙被認(rèn)為與PHT有關(guān)，而這些機(jī)能障礙被稱為門脈高壓性胃病。然而具體的失代償機(jī)理現(xiàn)在仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 兔抗鼠COX-1單克隆抗體；兔抗鼠COX-2單克隆抗體；兔抗鼠Fas-L單克隆抗體；山羊抗小鼠LgG；5%BSA封閉液；SABC。以上試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠20只，體重220～250 g（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組：半結(jié)扎門靜脈及左腎靜脈組；對(duì)照組：?jiǎn)渭儽┞队坞x門靜脈組。

1.2 方法

1.2.1 建立門靜脈高壓大鼠模型 大鼠于術(shù)前12 h禁食，術(shù)前8 h禁飲。3%戊巴比妥鈉針腹腔注射麻醉（0.1 mL/100 g BW）。實(shí)驗(yàn)組大鼠開(kāi)腹后游離暴露門靜脈主干后用7號(hào)鈍性針頭平行放置于門靜脈干，用3-0絲線結(jié)扎后將鈍性針頭抽出，待門靜脈結(jié)扎處部分充盈后輕輕結(jié)扎。然后暴露左腎上腺靜脈然后結(jié)扎。

1.2.2 大鼠門靜脈壓力測(cè)量 于術(shù)后兩周將所有大鼠麻醉后開(kāi)腹，實(shí)驗(yàn)組大鼠用20號(hào)套管針穿刺腸系膜上靜脈近端，退出針芯并將套管送入門靜脈結(jié)扎遠(yuǎn)端，該處測(cè)得壓力作為門靜脈壓；對(duì)照組則將套管針直接插入門靜脈處測(cè)壓，另一端接壓力傳感器（型號(hào)TSD104A），傳感器將收集的壓力信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)后輸入計(jì)算機(jī)，采用MP2100型多道生理記錄儀測(cè)定門靜脈壓力。

1.2.3 大鼠胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的表達(dá) 門靜脈半結(jié)扎兩周后處死大鼠，收集胃組織，甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片。用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的表達(dá)情況。應(yīng)用MIAS-2000型醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)測(cè)定胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的平均面積密度值，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其均值轉(zhuǎn)化為陽(yáng)性單位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 門靜脈壓力的變化

門靜脈半結(jié)扎兩周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠門靜脈的壓力為（28.25±2.89）cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），對(duì)照組大鼠門靜脈壓力為（13.07±2.74）cm H2O，實(shí)驗(yàn)組壓力明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的表達(dá)

胃組織中COX-1陽(yáng)性表達(dá)于黏膜層，可見(jiàn)黃色產(chǎn)物，陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，實(shí)驗(yàn)組COX-1表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯減弱。胃組織中COX-2陽(yáng)性表達(dá)于黏膜層，可見(jiàn)黃色產(chǎn)物，陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，實(shí)驗(yàn)組COX-2表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組無(wú)明顯差別。胃組織中Fas-L陽(yáng)性表達(dá)于黏膜層，可見(jiàn)棕黃色產(chǎn)物，陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，實(shí)驗(yàn)組Fas-L表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的表達(dá)（±s）

表1 胃組織中COX-1、COX-2、Fas-L的表達(dá)（±s）

注：對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) COX-1 COX-2 Fas-L對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組10 10 6.450±0.641 2.470±0.674*1.390±0.579 1.220±0.773 4.960±0.731 15.680±0.339*

3 討論

目前在認(rèn)識(shí)PHT的過(guò)程中，前列腺素類（PGs）在其中所起的作用仍比較有爭(zhēng)議。在人體試驗(yàn)中胃黏膜中的前列腺素水平顯示出增加，降低，或并無(wú)差異，但動(dòng)物試驗(yàn)中胃黏膜中前列腺素水平顯示降低[6-8]。但無(wú)論是在動(dòng)物模型還是人體試驗(yàn)中運(yùn)用前列腺素抑制劑后，胃黏膜均呈現(xiàn)不同程度的損害。環(huán)氧合酶（COX）是花生四烯酸合成前列腺素和血栓素中的關(guān)鍵酶。目前至少存在3種環(huán)氧化酶。COX-1主要存在于胃腸道以及大多數(shù)組織中，COX-2更容易在炎癥部位表達(dá)，而COX-3則是新一代抗炎鎮(zhèn)痛藥物的重要代表[9-10]。COX-1和COX-2在不同組織細(xì)胞中的作用有所不同，而對(duì)同一細(xì)胞在不同條件下其作用也不相同。COX-1與COX-2是否參與了門脈高壓性胃病形成過(guò)程以及其形成的機(jī)理目前并不清楚。

通過(guò)本試驗(yàn)筆者證明了兩步結(jié)扎法可以明顯的使大鼠門靜脈壓力增高，且可誘導(dǎo)內(nèi)臟血管阻塞和腸系膜靜脈擴(kuò)張。此外筆者發(fā)現(xiàn)門靜脈高壓大鼠模型中胃黏膜中COX-1表達(dá)降低而COX-2的表達(dá)并無(wú)明顯異常，同時(shí)細(xì)胞凋亡因子Fas-L的表達(dá)水平明顯增加。

TNF受體家族中凋亡因子Fas配體Fas-L除主要在活化的T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)外還出現(xiàn)在免疫豁免的部位。Fas作為細(xì)胞膜抗原主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抵抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用。Suda等人克隆了Fas抗原配體（Fas-L），已產(chǎn)生出Fas-L單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)Fas-L同樣有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

由于COX-1和COX-2的不同表達(dá)方式導(dǎo)致了其不同的病理生理作用。目前認(rèn)為COX-1源性酶催化生成的PGs參與了穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，而COX-2源性酶催化生成的COX-2則參與了炎性以及癌變的病理過(guò)程。胃部的PG合成主要為COX-1源性。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)COX-2源性PG在某種條件下可以參與胃黏膜的保護(hù)作用[11]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)PHT明顯的抑制了COX-1在胃黏膜中的表達(dá)，但是并沒(méi)有抑制COX-2的表達(dá)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PHT抑制了COX-1源性PGE2在胃黏膜的產(chǎn)生。而COX-1源性PGE2對(duì)胃黏膜具有保護(hù)作用，但其具體機(jī)制目前還不清楚。COX-2源性PGs被認(rèn)為參與局部炎癥反應(yīng)，目前已被廣泛接受，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明門脈高壓并沒(méi)有造成明顯的胃黏膜炎性反應(yīng)。在胃組織中由于COX-1分布的特異性，也可能大量的COX-1源性PGE2的表達(dá)掩蓋了COX-2源性PGs的作用。

總的來(lái)說(shuō)，F(xiàn)as-L的高表達(dá)說(shuō)明門脈高壓性胃腸病的形成過(guò)程中胃黏膜細(xì)胞的增殖作用減弱，同時(shí)存在促凋亡作用增強(qiáng)。由COX-1源性PGE2表達(dá)的降低導(dǎo)致胃黏膜防護(hù)機(jī)制減弱，也可能通過(guò)促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞凋亡及PGE2分泌紊亂引起的局部血管舒縮活性異常及體液調(diào)節(jié)失調(diào)后共同作用引起的內(nèi)臟血管高動(dòng)力實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，門脈高壓導(dǎo)致COX-1局部胃黏膜低表達(dá)可能通過(guò)凋亡途徑參與了門脈高壓胃病的形成過(guò)程，其具體機(jī)制目前還不清楚。而COX-2表達(dá)無(wú)差異表明炎癥反應(yīng)可能并沒(méi)有參與門脈高壓的形成過(guò)程，或者在其形成過(guò)程中不起主要作用。

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