地奧司明對腎缺血/再灌注大鼠血清和腎組織中TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8 和IL－10 水平的影響*

袁 銘， 石炳毅， 錢葉勇

(中國人民解放軍第309 醫(yī)院全軍器官移植中心，北京100091)

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)、白細胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)、IL－6、IL－8 和IL－10 等在腎缺血再灌注損傷過程中起重要作用［1－5］，其中TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 是主要的促炎因子，IL－10 是主要的抗炎因子［1］。國外研究證實地奧司明(diosmin，DOSM)具有抗炎癥反應作用，它可能通過降低內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，在毛細血管水平抑制白細胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放［6－8］。本實驗以SD大鼠腎缺血再灌注模型為基礎，以DOSM 作為干預手段，測定血清和腎臟組織中TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8 和IL－10 等炎癥因子以及血清肌酐(creatinine，Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平的變化。

材 料 和 方 法

1 材料

同齡健康雄性SD 大鼠180 只，體重200 ～220 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司SCXK 京2007－0001)。地奧司明:由南京正大天晴藥業(yè)股份有限公司饋贈(091113)。大鼠TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8 和IL－10 ELISA 試劑盒為R＆D 產(chǎn)品。

2 方法

2.1 實驗動物分組及I/R 模型制備 SD 大鼠隨機分為3 組:假手術組(sham)、腎缺血再灌注模型組(ischaemia－reperfusion，I/R)及DOSM +I/R 模型組(DOSM+I/R)，每組50 只。所有動物均先給予標準飲食及自由飲水3 d，然后給予藥物處理。在sham組和I/R 組術前給予5%阿拉伯膠1 mL 灌胃，每天2 次，而DOSM+I/R 組大鼠則給予DOSM(80 mg·kg－1·d－1，溶于5%阿拉伯膠中)灌胃，每天2 次，連續(xù)用藥10 d。第11 d 進行手術，術前12 h 禁食不禁水，2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹部正中切口進入腹腔，推開腸腔，暴露左側腎蒂，用無損傷微動脈夾夾閉腎動靜脈50 min，無菌生理鹽水紗布覆蓋切口，50 min 后松開血管夾使血液復流進行再灌注，松開血管夾后觀察腎臟顏色是否發(fā)生變化(所有缺血后的腎臟完全復流)，并于左腎開放血流前2 min 時切除右腎，然后縫合關閉切口。Sham 組按同樣步驟游離腎臟，并切除右腎，只是不鉗夾阻斷腎蒂血流。術后僅12 h、24 h 和48 h 組繼續(xù)原方案給藥。Sham 組、I/R 組和DOSM+I/R 組于術后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和48 h 各組分別從下腔靜脈采血后處死10 只大鼠，常規(guī)分離血清，置于－80 ℃冰箱保存以備檢測。取腎臟組織2.5 g，用磷酸鹽緩沖液5 mL 制成勻漿，離心后取上清液置于－80℃冰箱保存待測。

2.2 血清和腎臟組織中TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8 和IL－10 的測定 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行定量測定。血清中Cr 和BUN 水平應用本院檢驗科的全自動生化分析儀測定。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 血清和腎臟組織中TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 水平

由表1 ～4 可見I/R 和DOSM+I/R 組TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 水平隨病程進展而升高，于12 h 左右達高峰，此后降低，在相同時段I/R 和DOSM+I/R 組水平均顯著高于sham 組(P ＜0.05 或P ＜0.01，除血TNF－α 48 h 組外)，而且I/R 組水平顯著高于DOSM+I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01，除血TNF－α 1 h 組外)。

表1 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中TNF－α 水平比較Table 1. Comparison of serum and kidney tissue TNF－α levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

表1 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中TNF－α 水平比較Table 1. Comparison of serum and kidney tissue TNF－α levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

S:serum;T:kidney tissue. ☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01 vs sham group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h Sham 40.19±2.01(S) 41.67±1.93(S) 42.79±1.89(S) 45.67±1.93(S) 43.54±2.03(S) 42.79±1.75(S)161.62±3.46(T) 162.25±2.25(T) 164.63±1.19(T) 166.50±1.93(T) 161.00±2.14(T) 159.88±2.80(T)I/R 49.95±2.22(S)☆☆ 57.57±1.12(S)☆☆ 75.57±4.67(S)☆☆ 103.32±9.36(S)☆☆ 69.19±4.57(S)☆☆ 64.82±3.01(S)☆☆178.00±4.84(T)☆☆ 183.75±3.45(T)☆☆ 195.50±4.89(T)☆☆ 220.24±3.83(T)☆☆ 177.79±5.76(T)☆☆ 168.13±4.22(T)☆☆DOSM+I/R 48.91±2.11(S)☆☆ 55.32±1.80(S)☆☆△ 66.44±3.58(S)☆☆△△ 78.07±3.69(S)☆☆△△ 61.81±3.30(S)☆☆△△ 57.69±2.88(S)☆☆168.49±3.18(T)☆☆△△ 172.39±3.70(T)☆☆△△ 178.75±4.49(T)☆☆△△ 189.63±5.18(T)☆☆△△ 166.22± 2.86(T)☆△△ 157.13±3.76(T)△△△△

表2 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－1β 水平比較Table 2. Comparison of serum and kidney tissue IL－1β levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

表2 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－1β 水平比較Table 2. Comparison of serum and kidney tissue IL－1β levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

S:serum;T:kidney tissue. ☆☆P ＜0.01 vs sham group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h Sham 2.79±0.13(S) 2.89±0.11(S) 2.98±0.08(S) 3.07±0.08(S) 2.97±0.10(S) 2.84±0.10(S)8.17±0.27(T) 8.25±0.28(T) 8.33±0.29(T) 8.53±0.39(T) 8.31±0.25(T) 8.26±0.23(T)I/R 3.89±0.18(S)☆☆ 4.61±0.29(S)☆☆ 6.31±0.35(S)☆☆ 7.44±0.17(S)☆☆ 4.88±0.09(S)☆☆ 4.64±0.23(S)☆☆9.47±0.36(T)☆☆ 10.55±0.39(T)☆☆ 11.19±0.58(T)☆☆ 13.14±0.99(T)☆☆ 11.03±0.59(T)☆☆ 10.04±0.38(T)☆☆DOSM+I/R 3.67±0.16(S)☆☆△ 4.01±0.32(S)☆☆△△ 4.74±0.15(S)☆☆△△ 5.12±0.29(S)☆☆△△ 3.99±0.10(S)☆☆△△ 3.73±0.29(S)☆☆△9.07±0.40(T)☆☆△ 9.32±0.62(T)☆☆△△ 10.21±0.21(T)☆☆△△ 11.27±0.36(T)☆☆△△ 9.80± 0.68(T)☆☆△△ 9.05±0.39(T)☆☆△△△

表3 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－6 水平比較Table 3. Comparison of serum and kidney tissue IL－6 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

表3 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－6 水平比較Table 3. Comparison of serum and kidney tissue IL－6 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

S:serum;T:kidney tissue. ☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01 vs sham group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h Sham 61.46±1.79(S) 62.66±2.33(S) 62.53±2.19(S) 64.91±2.60(S) 60.91±2.15(S) 60.50±1.82(S)134.96±3.41(T) 138.46±3.00(T) 142.71±2.85(T) 137.96±2.62(T) 136.59±2.06(T) 134.09±2.56(T)I/R 74.02±4.17(S)☆☆ 77.40±3.24(S)☆☆ 81.23±3.02(S)☆☆ 90.61±5.67(S)☆☆ 74.65±2.51(S)☆☆ 69.03±5.38(S)☆152.66±3.32(T)☆☆ 166.29±3.60(T)☆☆ 170.51±2.65(T)☆☆ 171.94±5.66(T)☆☆ 158.40±1.79(T)☆☆ 151.40±2.04(T)☆☆DOSM+I/R 68.66±2.31(S)☆☆△△ 71.65±3.51(S)☆☆△△ 77.89±2.14(S)☆☆△ 83.51±1.48(S)☆☆△△ 68.15±1.95(S)☆☆△△ 65.03±2.80(S)☆△145.09±3.31(T)☆☆△△ 151.89±7.52(T)☆☆△△ 154.33±4.41(T)☆☆△△ 157.30±2.55(T)☆☆△△ 144.77±4.30(T)☆☆△△ 141.02±3.24(T)☆☆△△

表4 各組大鼠不同時點血和腎臟組織中IL－8 水平比較Table 4. Comparison of serum and kidney tissue IL－8 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

表4 各組大鼠不同時點血和腎臟組織中IL－8 水平比較Table 4. Comparison of serum and kidney tissue IL－8 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h Sham 270.93±7.20(S) 277.93±5.40(S) 284.68±4.04(S) 292.43±3.96(S) 278.56±3.15(S) 273.43±3.15(S)606.84±13.59(T) 618.34±13.05(T) 627.59±6.69(T) 637.46±7.05(T) 622.59±5.36(T) 617.59±8.84(T)I/R 287.77±7.29(S)☆☆ 363.98±12.02(S)☆☆ 389.36±7.02(S)☆☆ 423.11±7.98(S)☆☆ 380.40±9.41(S)☆☆ 354.53±9.86(S)☆☆734.21±16.19(T)☆☆ 774.29±21.82(T)☆☆ 797.89±22.54(T)☆☆ 864.44±17.04(T)☆☆ 763.90±22.22(T)☆☆ 725.03±27.50(T)☆DOSM+I/R 279.16±6.04(S)☆△ 321.26±5.70(S)☆☆△△ 353.11±8.88(S)☆☆△△ 372.15±5.88(S)☆☆△△ 308.03±13.07(S)☆☆△△283.03±9.37(S)☆△690.46±16.39(T)☆☆△△713.15±10.77(T)☆☆△△735.65±16.72(T)☆☆△△761.05±7.36(T)☆☆△△ 696.64±14.44(T)☆☆△△664.52±20.91(T)☆☆☆△△△

2 血清和腎臟組織中IL－10 水平

由表5 可見在I/R 組，IL－10 水平隨病程進展逐漸降低，而DOSM +I/R 組IL－10 水平隨病程進展逐漸增高，于12 h 左右達高峰，此后降低。在相同時段DOSM +I/R 組IL－10 水平均顯著高于sham組和I/R 組(P ＜0.01 或P ＜0.05)。

3 DOSM 對腎I/R 大鼠血清Cr 和BUN 水平的影響

從表6、7 可以看出I/R 和DOSM+I/R 組大鼠隨病程進展逐漸升高，I/R 和DOSM+I/R 組大鼠各時點血肌酐及尿素氮與sham 組比較均有顯著差異(P ＜0.01)。DOSM+I/R 治療組和I/R 組相比，血肌酐值均明顯降低，有顯著差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

表5 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－10 水平比較Table 5. Comparison of serum and kidney tissue IL－10 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

表5 各組大鼠不同時點血清和腎臟組織中IL－10 水平比較Table 5. Comparison of serum and kidney tissue IL－10 levels in every group(ng/L. ±s.n=10)

S:serum;T:kidney tissue. ☆☆P ＜0.01 vs sham group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h Sham 22.68±0.82(S) 22.82±0.74(S) 22.92±0.59(S) 23.93±0.66(S) 22.99±0.51(S) 22.78±0.41(S)52.96±1.77(T) 53.61±1.89(T) 55.09±2.24(T) 56.21±1.91(T) 53.84±0.84(T) 53.09±0.83(T)I/R 35.73±0.58(S)☆☆ 34.24±0.67(S)☆☆ 30.89±1.87(S)☆☆ 28.69±0.82(S)☆☆ 25.63±1.57(S)☆☆ 24.50±1.31(S)☆☆65.71±0.86(T)☆☆ 64.09±1.10(T)☆☆ 61.27±1.22(T)☆☆ 61.19±1.58(T)☆☆ 59.03±1.55(T)☆☆ 57.03±2.47(T)☆☆DOSM+I/R 36.76±0.89(S)☆☆△ 38.15±1.08(S)☆☆△△ 38.77±1.00(S)☆☆△△ 41.61±1.27(S)☆☆△△ 32.78±1.91(S)☆☆△△ 29.28±1.29(S)☆☆△67.25±1.34(T)☆☆△ 69.84±1.60(T)☆☆△△ 72.42±1.76(T)☆☆△△ 75.81±4.15(T)☆☆△△ 63.77±2.38(T)☆☆△△ 63.77±2.38(T)☆☆△△△

表6 各組大鼠不同時點血清Cr 水平情況Table 6. Comparison of serum Cr levels in every group(μmol/L. ±s.n=10)

表6 各組大鼠不同時點血清Cr 水平情況Table 6. Comparison of serum Cr levels in every group(μmol/L. ±s.n=10)

☆☆P ＜0.01 vs sham group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 3 h 12 h 24 h 48 h Sham 31.3 ±2.1 32.1 ±1.6 31.1 ±2.1 31.4 ±1.9 I/R 82.3 ±4.7☆☆ 260.4 ±9.6☆☆ 408.3 ±31.2☆☆ 617.4 ±53.6☆☆DOSM+I/R 76.3 ±2.9☆☆△ 222.1 ±7.5☆☆△△ 332.4 ±43.1☆☆△△ 480.0 ±97.9☆☆△△

表7 各組大鼠不同時點BUN 水平情況Table 7. Comparison of BUN levels in every group(mmol/L. ±s.n=10)

表7 各組大鼠不同時點BUN 水平情況Table 7. Comparison of BUN levels in every group(mmol/L. ±s.n=10)

☆☆P ＜0.01 vs sham group;△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group 3 h 12 h 24 h 48 h Sham 7.15 ±0.39 7.05 ±0.14 7.11 ±0.40 7.08 ±0.36 I/R 13.90 ±0.85☆☆ 35.48 ±3.35☆☆ 49.46 ±4.57☆☆ 69.17 ±8.14☆☆DOSM+I/R 10.84 ±0.79☆☆△△ 29.76 ±2.89☆☆△△ 35.63 ±4.05☆☆△△ 49.09 ±5.80☆☆△△

討 論

腎臟I/R 損傷是一個十分復雜的病理生理過程，涉及中性粒細胞浸潤、氧自由基產(chǎn)生、細胞凋亡、鈣超載，并有眾多炎癥介質(zhì)和免疫因子的參與，隨著對細胞因子網(wǎng)絡認識的迅速提高，細胞因子在腎臟I/R 過程中的作用日益受到重視［9］。TNF－α 是創(chuàng)傷或感染后機體最早產(chǎn)生的多功能細胞因子之一，它可刺激單核巨噬細胞合成和分泌IL－1β、IL－6和IL－8 等炎癥介質(zhì)，并能協(xié)同擴大其生物學效應。IL－10 主要由Th 細胞產(chǎn)生，為重要內(nèi)源性抗炎癥細胞因子，可抑制TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 的產(chǎn)生，從而減輕組織炎癥。研究發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 等促炎癥因子在缺血再灌注損傷過程中可能是至關重要的，而IL－10 等內(nèi)源性的抗炎癥因子相對或絕對減少，不足以對抗促炎癥因子產(chǎn)生和(或)拮抗其活性，亦可能在I/R 發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1－5，9］。因此針對細胞因子進行的靶向治療可能對減輕I/R 損傷具有一定的作用。

研究發(fā)現(xiàn)一些生物類黃酮可通過抑制炎癥細胞因子而發(fā)揮抗炎作用，如生物類黃酮槲皮素可通過抑制紫外線輻射誘導的炎癥細胞因子TNF－α(69%)、IL－1β(60%)、IL－6(80%)和IL－8(76%)表達而發(fā)揮抗輻射作用［10］;生物類黃酮黃芩苷能夠抑制香煙煙霧提取物所誘導的炎癥細胞因子TNF－α、IL－6 和IL－8 的表達和NF－kappa B 系統(tǒng)的激活，而且其抑制效果具有劑量依賴特點［11］。從藥用植物膠蟲樹提取的生物類黃酮紫鉚苷、異紫鉚苷和紫鉚花素，以及木樨草素(毛地黃黃酮)同樣也能夠選擇性抑制NF－kappa B 系統(tǒng)的激活，進而抑制TNF－α、IL－6 和IL－8 的表達［12－13］。

DOSM 是一種半合成的靜脈親和性藥物，屬于柑橘類生物黃酮，目前臨床上常用于慢性靜脈功能不全、靜脈潰瘍和急性痔瘡的治療。研究發(fā)現(xiàn)DOSM具有保護血管和提高靜脈張力的作用，能夠改善微循環(huán)和減輕局部炎癥程度的作用，還可增加淋巴回流和改善毛細血管的通透性，是血管保護藥和靜脈張力增強藥，作為生物類黃酮成分，DOSM 可通過降低一些內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，在毛細血管水平抑制白細胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而降低毛細血管的通透性，是否也具有抑制TNF－α、IL－6 等炎性細胞因子而發(fā)揮抗炎作用?本實驗以大鼠腎臟I/R 為基礎，以DOSM 為干預治療措施，觀察到:(1)在相同時段I/R 和DOSM +I/R組血清及腎臟組織中TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 水平顯著高于sham 組，而且隨病程進展而進一步升高，提示激活的炎癥細胞因子TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8 可能在I/R 過程中起重要作用。而且I/R 組水平也顯著高于DOSM +I/R 組，說明DOSM可顯著降低I/R 時TNF－α、IL－1β、IL－6 和IL－8的產(chǎn)生;(2)血清和腎臟組織中的IL－10 水平在I/R組隨病程進展降低，而在DOSM+I/R 組隨病程進展增高，說明DOSM 可顯著增加I/R 時IL－10 的產(chǎn)生;(3)腎臟組織中炎癥細胞因子水平較高，提示腎臟組織是炎癥細胞因子的重要來源;(4)DOSM +I/R 組腎功能受到的影響程度和I/R 組相比均明顯降低，說明DOSM 對腎臟I/R 損傷具有保護作用。

(致謝:感謝南京正大天晴藥業(yè)股份有限公司的資助!)

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