替米沙坦對大鼠心肌肥厚組織中RASSF1A表達的影響

王伯樂，趙玉蘭，張 強，董 靜

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心內科 鄭州450014

#通訊作者，女，1956年7月生，主任醫(yī)師，教授，研究方向:心力衰竭、冠心病及其相關疾病，E-mail:zyl6616@126.com

心肌肥厚是心肌對各種致肥厚因素的代償性反應，是心力衰竭、心律失常和心臟猝死的獨立危險因素［1］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)過度激活參與了心肌肥厚進程，其機制與Ras 信號通路激活有關［2］，因此抑制Ras 信號通路激活可抑制心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。RASSF1A 是RAS 相關結構域家族基因1 的成員之一，研究［3］表明RASSF1A 可能是Ras 信號通路中一個重要的負性調節(jié)因子。替米沙坦作為一種血管緊張素受體抑制劑(ARB)類藥物，可抑制RAAS 系統(tǒng)的激活，從而起到抗心肌肥厚的作用［4］。作者觀察了替米沙坦干預下大鼠肥厚心肌組織中RASSF1A 的表達，探討RASSF1A 與心肌肥厚的關系，為逆轉心肌肥厚提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 ASB240U 生物信號采集分析系統(tǒng)(成都遨生電子有限公司)、Biosens Digital Imaging System v1.6(上海山富科學儀器有限公司)、異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，批號101104)、Bio Rad PCR 儀、逆轉錄試劑盒及PCR 擴增試劑盒(Fermentas 公司)、兔抗大鼠RASSFA1A抗體(BioBasic 公司)。

1.2 實驗分組 8～10 周齡清潔雌性SD 大鼠30 只，購自河南省實驗動物中心，體質量200～220 g。將動物按隨機數(shù)字表法隨機分為3組:對照組、模型組和干預組，每組10 只。對照組背部皮下注射生理鹽水6 mL/(kg·d)，模型組和干預組背部皮下注射異丙腎上腺素3 mg/(kg·d)，連續(xù)10 d。在給予異丙腎上腺素的同時，干預組給予替米沙坦8.33 mg/(kg·d)灌胃，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 血流動力學測定 造模結束，動物禁食禁水24 h 后稱體質量，腹腔注射水合氯醛麻醉后常規(guī)剪毛，消毒后分離出右側頸總動脈，行插管，進行血流動力學測定。應用ASB240U 生物信號采集分析系統(tǒng)，穩(wěn)定5 mim 后，記錄連續(xù)5 個周期的下列指標，計算平均值進行分析:左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、壓力最大變化速率(±dP/dt)max。

1.4 心肌肥厚指數(shù)測定 血流動力學測定結束后，開胸取心臟，用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，用天平稱全心濕質量和左室濕質量(包括室間隔)，計算心臟指數(shù)和左室指數(shù)。

1.5 心肌病理學檢查 每只大鼠分別取左室心肌1 塊(約0.3 mg)迅速放入液氮中保存，剩余左心室組織經福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋制片，HE 染色，在光鏡(×200)下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

1.6 心肌組織中RASSF1A mRNA 的檢測 取Trizol 法提取左室心肌總RNA。取2.5 μg 總RNA，在M-MVL 酶作用下逆轉錄得cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。內參β-actin 上游引物序列5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物序列5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，擴增產物大小為150 bp; RASSF1A 上游引物序列5’-GAGACACCT GATCTTTCCCAAG-3 ’，下游引物序列5 ’-AGAACGTGCAGATGCTTAACAG-3’，擴增產物大小為481 bp。反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，30 個循環(huán);72℃延伸10 min。取PCR 產物10 μL，行瓊脂糖凝膠電泳，用Gel-Pro 凝膠掃描成像儀采集圖像并分析，以RASSF1A 與β-actin 條帶灰度值的比值表示RASSF1A mRNA 的相對表達量。

1.7 心肌組織中RASSF1A 蛋白的檢測 心肌組織切片脫蠟，根據(jù)SP 試劑盒說明進行操作，修復抗原山羊血清封閉，加入兔抗大鼠RASSF1A 抗體(按1∶300 稀釋)4℃孵育過夜，DAB 顯色，在光鏡下觀察RASSF1A 蛋白表達，并采用Biosens Digital Imaging System v1.6 圖像分析系統(tǒng)采集圖像行半定量分析。RASSF1A 蛋白陽性反應信號呈棕黃色，以陽性區(qū)平均積分光密度表示RASSF1A 蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。3組間血流動力學參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及心肌組織中RASSF1A mRNA 和蛋白表達的比較應用單因素方差分析及LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠血流動力學參數(shù)的比較 見表1。與對照組相比，模型組和干預組LVEDP 升高，LVSP 和(±dP/dt)max下降;與模型組相比，干預組上述指標變化小于模型組。

2.2 3組大鼠心肌肥厚指數(shù)比較 見表2。與對照組相比，模型組和干預組的心臟指數(shù)、左室指數(shù)均明顯增加，但干預組的變化幅度小于模型組。

2.3 3組大鼠心肌組織病理學表現(xiàn) 見圖1。對照組心肌細胞排列規(guī)律整齊; 模型組心肌細胞排列紊亂，有大量的心肌纖維增生并伴有炎性滲出;干預組病理學表現(xiàn)介于對照組和模型組之間。

2.4 3組大鼠心肌組織RASSF1A mRNA 和蛋白的表達 見圖2、3 和表3。與對照組相比，模型組和干預組RASSF1A mRNA 和蛋白表達降低;與模型組相比，干預組RASSF1A mRNA 和蛋白的表達增高。

表1 3組血流動力學參數(shù)的比較

表2 3組大鼠心肌肥厚指數(shù)的比較

圖3 3組大鼠心肌組織RASSF1A mRNA 的表達

表3 3組大鼠RASSF1A mRNA 和蛋白的表達

3 討論

RAAS 的過度激活主要與Ras 信號通路有關。Ras 信號通路涉及多種疾病的發(fā)生，如腫瘤和心肌肥厚，該通路被激活后首先使位于細胞膜內側的Ras 蛋白活化為Ras-GTP，Ras-GTP 可以使下游Raf磷酸化，磷酸化的Raf 以級聯(lián)反應的方式調節(jié)涉及心肌肥厚發(fā)生的相關靶蛋白如轉錄因子、細胞骨架蛋白、蛋白激酶調節(jié)因子等，同時磷酸化的Raf 又可以活化Ras 蛋白，使其保持Ras-GTP 狀態(tài)，維持Ras信號通路不斷激活，最終使心臟由心肌肥厚逐漸發(fā)展至心力衰竭［5］。因此阻斷Ras-GTP 與磷酸化Raf之間的這種正反饋作用將是阻遏心肌肥厚發(fā)展至心力衰竭的關鍵。

該研究中，連續(xù)皮下注射異丙腎上腺素10 d后，大鼠LVEDP、心臟指數(shù)及左室指數(shù)均顯著增高，而LVSP、(±dP/dt)max均下降，病理檢查亦顯示大鼠心肌細胞排列紊亂伴大量心肌纖維增生和炎性滲出，表明模型成功建立［6］。該模型主要是通過異丙腎上腺素與β 受體結合使RAAS 過度激活而實現(xiàn)的。在造模同時給予替米沙坦干預后，大鼠LVEDP、心臟指數(shù)及左室指數(shù)趨于正常，LVSP、(±dP/dt)max無明顯異常，心肌細胞排列較規(guī)整，說明替米沙坦能有效防止心肌肥厚的發(fā)生，該作用與抑制RAAS 的過度激活有關［4］。

RASSF1A 是在肺癌和乳癌中發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因家族成員之一。RASSF1A蛋白是一種支架蛋白，本身不具有酶的活性，通過蛋白-蛋白之間的相互作用參與各種生物代謝途徑如基因轉錄、信號傳導、細胞黏附和凋亡等一系列生物效應。有研究［7］表明RASSF1A 蛋白作為Nore1α 異二聚體可以與Ras-GTP 結合，調節(jié)Ras-GTP 的結構和功能。該研究發(fā)現(xiàn)，與正常心肌組織相比，RASSF1A mRNA 和蛋白在肥厚心肌組織中的表達明顯減少，說明RASSF1A 可能是心肌肥厚的負性調節(jié)因子，其機制可能與調節(jié)Ras-GTP 的結構和功能有關。同時，該實驗還發(fā)現(xiàn)，在替米沙坦干預下，大鼠肥厚心肌組織中RASSF1A mRNA 和蛋白表達增多，說明替米沙坦能夠上調RASSF1A mRNA 和蛋白表達，這可能是其抗心肌肥厚的機制之一。

綜上所述，替米沙坦抗心肌肥厚的機制可能與調節(jié)RASSF1A 的表達有關，但具體機制仍需進一步研究。

［1］Milani RV，Drazner MH，Lavie CJ，et al.Progression from concentric left ventricular hypertrophy and normal ejection fraction to left ventricular dysfunction［J］.Am J Cardiol，2011，108(7):992

［2］Zhang P，Mende U.Regulators of G-protein signaling in the heart and their potential as therapeutic targets［J］.Circ Res，2011，109(3):320

［3］Oceandy D，Pickard A，Prehar S，et al.Tumor suppressor Ras-association domain family 1 isoform A is a novel regulator of cardiac hypertrophy［J］.Circulation，2009，120(7):607

［4］Mantziari L，Guha K，Khalique Z，et al.Relation of dosing of the renin-angiotensin system inhibitors after cardiac resynchronization therapy to long-term prognosis［J］.Am J Cardiol，2012，109(11):1691

［5］Lorenz K，Schmitt JP，Vidal M，et al.Cardiac hypertrophy:targeting Raf/MEK/ERK1/2-signaling［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41(12):2351

［6］Barbosa ME，Alenina N，Bader M，et al.Induction and analysis of cardiac hypertrophy in transgenic animal models［J］.Methods Mol Med，2005，112:339

［7］Avruch J，Xavier R，Bardeesy N，et al.Rassf family of tumor suppressor polypeptides［J］.J Biol Chem，2009，284(17):11001