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    左心缺血再灌注大鼠急性肺損傷組織中ICAM-1與TNF-α的表達(dá)*

    2012-12-17 07:39:24王煜霞宋曉榮姬明麗王建剛劉自國(guó)
    關(guān)鍵詞:左心粒細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞

    王煜霞,宋曉榮,姬明麗 ,王建剛,郭 勇,劉自國(guó)

    1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 新鄉(xiāng)453003 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室 新鄉(xiāng)453003 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng)453003

    #通訊作者,女,1975年7月生,碩士,副教授,研究方向:肺損傷機(jī)制及干預(yù),E-mail:lmjsy@sina.com

    部分左心心肌梗死的患者溶栓治療后,病情非但沒(méi)有緩解,反而導(dǎo)致呼吸功能障礙,因此探討左心缺血再灌注后急性肺損傷的機(jī)制可為臨床治療左心功能不全所致的急性呼吸衰竭提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。作者從左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型入手,探討?zhàn)じ椒肿?1 (inflammatory cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及對(duì)呼吸功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SD 大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,雌雄不限,體質(zhì)量250~350 g,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組30 只。

    1.2 主要儀器及試劑 BL-420 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)購(gòu)于泰盟生物儀器有限公司; TNF-α 酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; TNFα 和ICAM-I SP-0023 免疫組化試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

    1.3 動(dòng)物造模、檢測(cè)項(xiàng)目及方法 2組在進(jìn)行胸部手術(shù)操作之前均在劍突下面作一小切口,暴露膈肌,將2 個(gè)針式電極掛于膈肌兩側(cè),電極與BL-420 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)連接,記錄呼吸曲線。左心室缺血再灌注肺損傷模型的制作參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組大鼠全麻后開(kāi)胸,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的前降支,30 min 后,剪開(kāi)結(jié)扎線,恢復(fù)血供,造成缺血后再灌注損傷。對(duì)照組只穿線,不結(jié)扎此血管。

    選擇缺血30 min(T1)、再灌注30 min(T2)、再灌注60 min(T3)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取10 只大鼠,在記錄呼吸曲線后均經(jīng)頸外靜脈取外周血5 mL,之后處死動(dòng)物,取肺,行支氣管肺泡灌洗,取支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF)5 mL; 采用酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)外周血和BALF 中TNF-α 的水平。

    取肺右下葉,以40 g/L 多聚甲醛固定,石蠟包埋、5 μm 厚切片,HE 染色,光鏡下觀察各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化,免疫組化SP 法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠肺組織TNF-α、ICAM-1 的表達(dá)。TNF-α 免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì),呈棕黃色至深棕黃色顆粒。ICAM-1 免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒,分布于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。參考文獻(xiàn)[2]采用半定量法判定結(jié)果:選10 個(gè)高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞,無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為“-”,陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25% 為“+”,25%~為“”,>75%為“”。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 處理數(shù)據(jù),2組呼吸曲線參數(shù)的比較、BALF 和外周血中TNF-α 水平的比較采用2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析;2組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織ICAM-1、TNF-α 蛋白表達(dá)情況的比較采用秩和檢驗(yàn); 實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中ICAM-1 與TNF-α 蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用spearman 秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 2組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)組雙肺可見(jiàn)散在的淤血點(diǎn),偶見(jiàn)融合的大面積淤血斑,以肺底部和背側(cè)面多見(jiàn),輕擠切面有淡紅色泡沫樣液體溢出,T1 時(shí)肺間隔內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管擴(kuò)張;T2 時(shí)可見(jiàn)肺泡間隔增厚,間隔內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);T3 時(shí)可見(jiàn)彌漫性肺間隔增厚、浸潤(rùn)明顯,有水腫液,呈急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。對(duì)照組雙肺偶見(jiàn)淤血點(diǎn),切面無(wú)泡沫樣液體溢出,未見(jiàn)中性粒細(xì)胞,肺泡間隔正常,無(wú)急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。

    2.2 2組大鼠呼吸曲線比較 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組大鼠呼吸曲線的幅度、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

    表1 2組大鼠呼吸曲線的比較(n=10)

    2.3 2組大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平的比較 見(jiàn)表2。

    2.4 2組大鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α 蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖1(僅選擇T2 時(shí)2組大鼠肺組織ICAM-1、TNF-α 蛋白的表達(dá)情況),表3、4。T1、T2、T3 時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織ICAM-1 蛋白的表達(dá)與TNF-α 蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān),T1 時(shí)rS=0.362,P =0.001;T2時(shí)rS= 0.741,P = 0.001; T3 時(shí)rS= 0.803,P =0.026,見(jiàn)表5。

    表2 2組大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平比較(n=10)ng/L

    圖1 T2 時(shí)2組大鼠肺組織ICAM-1(A)和TNF-α(B)蛋白的表達(dá)(SP,×400)

    表3 2組大鼠肺組織ICAM-1 表達(dá)的比較

    表4 2組大鼠肺組織TNF-α 表達(dá)的比較

    表5 實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中CAM-1 與TNF-α 蛋白表達(dá)的關(guān)系(n=10)

    3 討論

    該研究采用左心缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肺組織病理形態(tài)學(xué)改變呈急性炎癥反應(yīng)的表現(xiàn),且實(shí)驗(yàn)組大鼠呼吸曲線的幅度、強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間均低于對(duì)照組,提示實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織發(fā)生炎性反應(yīng),引起呼吸功能減退,出現(xiàn)急性肺損傷。

    中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎性損傷過(guò)程的第一步,也是炎性損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵。ICAM-1 是一種主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,生理狀態(tài)下在大多數(shù)組織內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)[3-4]。當(dāng)病理性因素導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1上調(diào)時(shí),上調(diào)的ICAM-1 與活化的中性粒細(xì)胞表面的整合素相互作用,而致中性粒細(xì)胞的變形性降低[5],與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力大大增加,并向血管的特定部位遷移,從而發(fā)生白細(xì)胞黏附聚集,是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞參與炎癥損傷級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)的基礎(chǔ)。TNF-α 是一種重要的前炎性細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)多種化學(xué)趨化素和黏附因子的表達(dá)[6-8]。有實(shí)驗(yàn)[9]證明中性粒細(xì)胞與TNF-α 作用后的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)ICAM-1 黏附,誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基,中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移及水腫形成。該研究結(jié)果顯示左心缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平增高,且肺組織ICAM-1 蛋白表達(dá)上調(diào),證實(shí)了TNF-α 水平上調(diào)促使肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1 增多。

    此外,該研究結(jié)果還顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織ICAM-1 和TNF-α 蛋白表達(dá)均上調(diào),二者的表達(dá)呈正相關(guān),結(jié)合作者前期研究[10-11]結(jié)果:TNF-α 的表達(dá)上調(diào)會(huì)使肺部炎性細(xì)胞因子IL-8、IL-1β 等的表達(dá)上調(diào),使炎癥反應(yīng)失衡,可進(jìn)一步擴(kuò)大炎性損傷,推測(cè)左心缺血再灌注后肺循環(huán)中TNF-α 增加,肺組織ICAM-1表達(dá)上調(diào),細(xì)胞因子釋放增加,擴(kuò)大炎癥反應(yīng),炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)失衡,引起炎癥損傷,導(dǎo)致呼吸功能減退。

    綜上所述,左心缺血再灌注誘導(dǎo)的急性肺損傷機(jī)制與TNF-α 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1 上調(diào),啟動(dòng)白細(xì)胞的黏附聚集釋放反應(yīng),擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),致炎癥反應(yīng)失衡有關(guān)。

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