中國獼猴CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制抗結(jié)核分枝桿菌特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)*

秦 潔，龔光明 ，杜 英，孫石磊，楊 璇，朱 沙，軒小燕，劉萍萍，王 娜，許予明

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州450001

#通訊作者，男，1973年12月生，博士，講師，研究方向:抗感染免疫、干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail:gmgong@zzu.edu.cn

結(jié)核病仍然是世界上主要致死性疾病之一［1-2］，近期世界范圍內(nèi)出現(xiàn)大量致死性多重耐藥菌株。造成防治結(jié)核分枝桿菌感染進展緩慢的主要原因是對結(jié)核分枝桿菌的致病機制以及人類免疫反應(yīng)的具體機制尚不十分清楚。闡明卡介苗(BCG)感染引發(fā)機體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)機制將非常有利于發(fā)現(xiàn)新的防治結(jié)核分枝桿菌感染的有效措施［1，3］。作者最近的研 究 發(fā) 現(xiàn)［4-7］，CD4+CD25+調(diào) 節(jié) 性T 淋 巴 細(xì) 胞(CD4+CD25+regulatory T cell，Tregs)可 以 抑 制Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞的體外抗原特異性和非特異性擴增，對人類抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)有負(fù)調(diào)節(jié)作用。靈長類動物因為具有和人類非常接近的生物學(xué)特征，常被用來作為研究人類感染性疾病的珍貴動物模型［8-10］。作者觀察了中國獼猴抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中Tregs 對效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗結(jié)核桿菌特異性免疫反應(yīng)的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6 只雄性中國獼猴，由美國芝加哥伊利諾伊州立大學(xué)生物資源中心提供，3 個月內(nèi)接受過一次靜脈注射106BCG。年齡3～6 歲，體質(zhì)量3.1～6.9 kg。動物飼養(yǎng)和實驗方法均經(jīng)該校動物關(guān)懷與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要抗體、試劑和儀器設(shè)備 純化鼠抗人CD28、CD3 及PE-Cy7 和PB 融合的CD3 抗體為BD Pharmingen 公司產(chǎn)品，PB 融合的鼠抗人CD4、PECy7 融合的CD8 為eBioscience 公司產(chǎn)品，純化或FITC 融合的TCR Vγ2 抗體、純化或FITC 融合的TCR Vδ2 抗體購自Endogen 公司，APC/PE 融合的山羊抗鼠IgG 單抗購自Biolegend 公司，CFSE 細(xì)胞擴增試劑盒(C34554)購自Invitrogen/Molecular Probes 公司，靈長類非人動物Tregs 分離試劑盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG 磁珠、MACS Multi-Stand(130-042-303)、LD(130-042-901)和MS(130-042-201)分離柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分離單位均為Miltenyi Biotec 產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀Summit V4.3 分析軟件均為美國DakoCytomation 公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞分離 ①外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離:采用密度梯度離心法從15 mL EDTA 抗凝的獼猴外周血液中分離PBMCs。②Tregs 的分離:從PBMCs 中陰性分選CD4+T 淋巴細(xì)胞，再從CD4+T 淋巴細(xì)胞中陽性分選Tregs。具體分選方法參見試劑說明書。

1.4 CFSE 和PKH26 標(biāo)記細(xì)胞 CFSE 標(biāo)記去除Tregs 的PBMCs。PKH26 紅標(biāo)記Tregs。具體標(biāo)記方法參見試劑說明書。

1.5 Tregs 抑制功能分析-CFSE 基礎(chǔ)的細(xì)胞擴增分析實驗 具體方法參見文獻［4］。將CFSE 標(biāo)記的、去除Tregs 的PBMCs 以2×105/孔的密度接種96 孔板，分6組。①空白對照組:除了CFSE 標(biāo)記的PBMCs 外無任何添加。②CD3/CD28組:含純化鼠抗人CD3 和CD28 單克隆抗體(5 μg/L)。③PPD組:含PPD(15 L)。④Tregs組:將純化并經(jīng)PKH26標(biāo)記的Tregs 以2×105/孔的密度接種以上含CFSE標(biāo)記的PBMCs 中，即①+④。⑤Tregs +CD3/CD28組:②+④。⑥Tregs +PPD組:③+④。每孔終體積為0.2 mL，用含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕地混勻完全，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)7 d 后，收集細(xì)胞進行CD3、CD4、CD8、Vδ2熒光抗體染色。24 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀對經(jīng)過熒光抗體染色的細(xì)胞進行檢測。使用Summit V4.3 軟件對CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+Vδ2+T 淋巴細(xì)胞的CFSE 信號強度進行分析，分析時根據(jù)SSC/FSC 和FSC/Pulse Width 點陣對PBL 設(shè)門，并排除PKH26+細(xì)胞的干擾。細(xì)胞擴增比例以CFSEdim細(xì)胞所占CFSE+細(xì)胞的百分比計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad 軟件，采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞擴增的比例，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞的擴增比例見表1。

表1 各組CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞的擴增比例 %

3 討論

該研究中，作者采用一種敏感的、多用途的CFSE 基礎(chǔ)的實驗方法對Tregs 的抑制功能進行體外分析［9］。CFSE 是一種無色無熒光的染料，當(dāng)和被染色細(xì)胞在37℃條件下共同孵育時，CFSE 被細(xì)胞攝入，從而均勻地散布在胞質(zhì)中。CFSE 被胞質(zhì)中的脂酶分解成熒光化合物，這種熒光化合物能和細(xì)胞內(nèi)的胺類結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，隨細(xì)胞分裂而存在于子代細(xì)胞中，只是熒光強度有所減弱。因此，利用CFSE 熒光強度減弱的特性，可以用于檢測CFSE 標(biāo)記細(xì)胞的擴增情況。

通過CFSE 基礎(chǔ)的流式細(xì)胞術(shù)分析，作者證實中國獼猴Tregs 對Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞以及CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的PPD 抗原特異性和抗原非特異性擴增有強大的體外抑制功能。Tregs 不僅抑制傳統(tǒng)觀點認(rèn)為的在抗結(jié)核感染免疫中發(fā)揮重要作用的CD4+T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的PPD 抗原特異性的體外擴增，而且抑制CD8+T 淋巴細(xì)胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞［7］產(chǎn)生的PPD 抗原特異性的體外擴增。Tregs 具有體外抑制CD8+T 淋巴細(xì)胞和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗結(jié)核分枝桿菌抗原特異性擴增的功能，一方面表明最近人們越來越認(rèn)識到CD8+T 淋巴細(xì)胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞［7］在機體產(chǎn)生的抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫中的重要作用; 另一方面，這些證據(jù)表明Tregs 對在BCG 感染過程中共同發(fā)揮作用的、包括CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞［7］在內(nèi)的廣泛效應(yīng)性/記憶性細(xì)胞池，都有著強大的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Tregs 在機體產(chǎn)生抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫過程中，可能不僅控制傳統(tǒng)的CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞［10］介導(dǎo)的抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫，而且控制Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫［7］。

總之，該研究結(jié)果表明，Tregs 可抑制CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核桿菌特異性免疫反應(yīng)。

［1］Huang D，Qiu L，Wang R，et al.Immune gene networks of mycobacterial vaccine-elicited cellular responses and immunity［J］.J Infect Dis，2007，195(1):55

［2］Li L，Lao SH，Wu CY.Increased frequency of CD4(+)CD25(high)Treg cells inhibit BCG-specific induction of IFN-gamma by CD4(+)T cells from TB patients［J］.Tuberculosis (Edinb)，2007，87(6):526

［3］Soysal A，Millington KA，Bakir M，et al.Effect of BCG vaccination on risk of Mycobacterium tuberculosis infection in children with household tuberculosis contact:a prospective community-based study［J］.Lancet，2005，366(9495):1443

［4］龔光明，秦潔，軒小燕，等.中國獼猴CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞抑制Vγ2Vδ2 T 細(xì)胞的體外擴增［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2011，7(4):529

［5］Chen X，Zhou B，Li M，et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease［J］.Clin Immunol，2007，123(1):50

［6］Scott-Browne JP，Shafiani S，Tucker-Heard G，et al.Expansion and function of Foxp3-expressing T regulatory cells during tuberculosis［J］.J Exp Med，2007，204(9):2159

［7］Li L，Wu C.CD4+CD25+Treg cells inhibit human memory {gamma}{ delta} T cells to produce IFN-{ gamma} in response to M.tuberculosis antigen ESAT-6［J］.Blood，2008，111(12):5629

［8］Shen Y，Zhou D，Qiu L，et al.Adaptive immune response of Vγ2Vδ2+T cells during mycobacterial infections［J］.Science，2002，295(5563):2255

［9］Gong G，Shao L，Wang Y，et al.Phosphoantigen-activated Vγ2Vδ2 T cells antagonize IL-2-induced CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells in mycobacterial infection［J］.Blood，2009，113(4):837

［10］Chen CY，Huang D，Wang RC，et al.A critical role for CD8 T cells in a nonhuman primate model of tuberculosis［J］.PLoS Pathog，2009，5(4):e1000392