河南漢族動(dòng)脈硬化性腦梗死人群血小板膜糖蛋白Iba基因VNTR多態(tài)性檢測(cè)*

李 濤，尚迎輝，白峻瑜，石聰聰，封青川，賀 穎，鄭 紅

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州450001 2)鄭州市市直機(jī)關(guān)醫(yī)院內(nèi)科 鄭州450007#通訊作者，女，1966年3月生，博士，教授，研究方向:遺傳性疾病致病基因的篩選，E-mail:hzheng@zzu.edu.cn

血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib-IX 復(fù)合物是血小板膜的主要糖蛋白之一，在血小板表面形成血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的受體，參與血小板黏附于受損血管壁的反應(yīng)，其亞單位GPIba 基因多態(tài)性能夠改變GPIb-IX-V 的抗原性，調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，影響血小板的黏附、聚集和活化反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、血栓栓塞的形成和血管痙攣等各個(gè)環(huán)節(jié)，與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。其中GPIba 編碼巨球肽區(qū)域39個(gè)堿基的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats，VNTR)數(shù)目的改變可致多肽鏈上399 位絲氨酸殘基到411 位蘇氨酸殘基的改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。目前關(guān)于血小板GPIba 基因VNTR 長(zhǎng)度多態(tài)性與動(dòng)脈硬化性腦梗死(atherothrombotic brain infarction，ABI)關(guān)系的研究［2-4］結(jié)論尚不一致。作者應(yīng)用PCR 法對(duì)河南漢族434例ABI患者和500例健康對(duì)照進(jìn)行GPIba 基因VNTR 長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)，探討GPIba 基因VNTR 多態(tài)性與ABI的關(guān)系，為ABI 的防治提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 遵循知情同意原則，隨機(jī)選取2004年12月至2006年6月河南省二甲以上醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的ABI 患者434例(病例組)，均經(jīng)臨床檢查(病史、體征、生化檢驗(yàn)、CT 或MRI)確診。434例中男280例，女154例，年齡28～88(62.2±12.2)歲。正常對(duì)照選自同期健康體檢的隨機(jī)個(gè)體500 人(對(duì)照組)，其中男305 人，女195 人，年齡21～89(62.6±12.2)歲。該研究個(gè)體間無血緣關(guān)系，均為河南漢族人群。排除患有心、腦血管疾病及肝、腎、內(nèi)分泌疾病者。

1.2 GPIba 基因VNTR 多態(tài)性檢測(cè) 抽取上述研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血3 mL，EDTA 抗凝，用常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA，其含量用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。VNTR 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列5’-CACTACTGAAC CAACCCCAAG-3’，下游引物序列5’-TTGTG GCAGACSCCAGGATGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為195～312 bp。PCR 擴(kuò)增體系:模板DNA 2 μL，STR 10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各6 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL，純水補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，63℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)40 次;72℃延伸5 min。25 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像儀上觀察并照相。由于GPIba 基因VNTR 多態(tài)性可產(chǎn)生4種等位基因類型，即A:312 bp 基因片段，含有4 個(gè)重復(fù)序列;B:273 bp 基因片段，含有3 個(gè)重復(fù)序列;C:234 bp 基因片段，含有2 個(gè)重復(fù)序列;D:195 bp 基因片段，含有1 個(gè)重復(fù)序列。因此，理論上可產(chǎn)生AA、BB、CC、DD、AB、AC、AD、BC、BD 及CD 共10 種基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較2組間VNTR 基因型頻率的差異;計(jì)算比數(shù)比(OR)及95%CI。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GPIba 基因VNTR 多態(tài)分型 見圖1。該研究中病例組未發(fā)現(xiàn)BB 和AB 基因型，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)AA、BB 和AB 基因型。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)照組各基因型頻率的分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=2.887，P=0.089)，說明該樣本具有良好的人群代表性。

2.3 2組GPIba VNTR 各基因型及等位基因頻率比較 見表1、2。

2.4 河南漢族人群與其他地區(qū)人群GPIba 基因VNTR 等位基因頻率的比較 見表3。

表2 ABI組和對(duì)照組GPIba的VNTR 各等位基因頻率的分布例(%)

表3 河南漢族人群VNTR 等位基因頻率與其他地區(qū)人群相應(yīng)各等位基因分布頻率比較

3 討論

GPIb-IX 復(fù)合物是血小板膜的主要糖蛋白之一。GPIb 相對(duì)分子質(zhì)量約為165 000，有2 個(gè)亞單位，即GPIba 和GPIbb。GPIba 含有凝血酶高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，可在低凝血酶濃度時(shí)激活血小板，進(jìn)而影響血小板的黏附、聚集和活化反應(yīng)過程，促進(jìn)血栓形成［11］。

GPIba 基因位于17 號(hào)染色體短臂，具有高度多態(tài)性。第一個(gè)被確定的多態(tài)性即VNTR。隨著VNTR 重復(fù)序列次數(shù)的增加可使vWF 與凝血酶在GPIba 的結(jié)合位點(diǎn)延伸到細(xì)胞膜外，遠(yuǎn)離血小板膜。這種結(jié)構(gòu)變化的潛在影響是將靶分子暴露于更大的剪切力之下，導(dǎo)致剪切力誘導(dǎo)的vWF 和GPIba 相互作用的閾值降低。此外，與vWF 的有效結(jié)合需要至少包含2 條GPIba 多態(tài)的超復(fù)合體，雜合子含兩種等位基因長(zhǎng)度不對(duì)稱可能影響GPIba 與配體結(jié)合［12］。因此，趙宇等［13］認(rèn)為，如果GPIba 基因VNTR 多態(tài)性與血栓性疾病的發(fā)生相關(guān)，應(yīng)該是VNTR 含重復(fù)序列較多的等位基因和雜合子基因型。

該研究發(fā)現(xiàn):在河南漢族人群中，病例組GPIba基因CD 基因型頻率和BC 基因型頻率高于對(duì)照組，且CD 和BC 基因型個(gè)體發(fā)生ABI 的風(fēng)險(xiǎn)升高，提示CD 與BC 基因型可能是河南地區(qū)漢族人群ABI 發(fā)生的易感基因型，尤其是CD 基因型在河南漢族人群的分布更為普遍，這種易感基因型的風(fēng)險(xiǎn)更大;這符合Jilma-Stohlawetz 等［12］關(guān)于VNTR 雜合子基因型CD 擁有較低的剪切誘導(dǎo)閾值，導(dǎo)致患病風(fēng)險(xiǎn)增大的假設(shè)。該研究還顯示，攜帶B 等位基因的個(gè)體發(fā)生ABI 的風(fēng)險(xiǎn)增加，與Mikkelsson 等［14］報(bào)道B 等位基因是青壯年心肌梗死的危險(xiǎn)因素的研究結(jié)果一致。此外，該研究還顯示病例組DD 基因型頻率低于對(duì)照組，且DD 基因型個(gè)體發(fā)生ABI 的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，提示VNTR 多態(tài)性中DD 基因型與ABI 的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，DD 基因型可能是河南地區(qū)ABI 發(fā)生的遺傳保護(hù)因子。

另外，與中國(guó)蒙古族人群、高加索人群、非洲人群和印度人群比較，4 種等位基因頻率差異較大，由此也說明了該VNTR 多態(tài)性分布的復(fù)雜性。

綜上所述，VNTR 多態(tài)性中CD 和BC 雜合基因型可能是河南地區(qū)漢族人群ABI 發(fā)生的危險(xiǎn)因子，而DD 基因型可能是遺傳保護(hù)因子。

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