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    大鼠腦部微透析實(shí)驗(yàn)中透析效率的研究

    2012-12-15 03:55:56盧劍清
    生命科學(xué)儀器 2012年5期
    關(guān)鍵詞:透析液顱骨探針

    盧劍清,盧 嵩

    (北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100081)

    微透析技術(shù)是利用可溶性小分子可以自由穿透半透膜,而大分子物質(zhì)被截留的特點(diǎn),以一根微小的探針置于需要檢測的組織部位,以一定速率向探針內(nèi)灌注與組織內(nèi)體液相似的等滲溶液,在探針頂端的半透膜處與體內(nèi)小分子物質(zhì)透過濃度梯度進(jìn)行物質(zhì)交換,從而使其進(jìn)入透析液。這樣通過收集透析液的方法并進(jìn)行檢測就可以實(shí)時反映生物體內(nèi)小分子物質(zhì)的情況[1,2]。

    本文將微透析探針植入大鼠腦部黑質(zhì)區(qū),在透析液中加入一定濃度的多巴胺(Dopamine,DA)進(jìn)行灌注,通過測定透析后透析液中的DA濃度,對研究微透析探針的透析效率進(jìn)行了研究[3]。

    1 材料

    1.1 微透析實(shí)驗(yàn)

    Wistar大鼠(200~300g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司);MAB6.14.1型微透析探針(瑞典MAB公司);CMA402型微量注射泵、CMA/120 清醒動物活動裝置、Univentor 820 微量低溫分步收集器(瑞典CMA公司);SN-1N型腦立體定位儀(日本Narshige公司);牙科鉆(韓國STRONG公司);戊巴比妥鈉(美國Amresco公司);多巴胺(美國Sigma公司)自凝造牙粉(德國賀利氏公司);NaCl、KCl、CaCl2、H2O2(分析純,北京化工廠);手術(shù)刀、止血鉗、手術(shù)剪刀、手術(shù)鑷子等(上海醫(yī)療器械廠)。

    1.2 色譜分析

    582型二元泵、542型自動進(jìn)樣器、5600A型庫倫陣列檢測器、6210型電極(美國ESA公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Thermo Fisher公司);Discovery?HS F5柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm,美國Supelco公司)、檸檬酸、Na2EDTA(美國Amresco公司)、Na2HPO4(分析純,北京化工廠)

    2 方法

    2.1 微透析實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 微透析探針的植入

    取250g左右的大鼠,稱重后以70mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉,待其昏迷后將其固定在腦立體定位儀上,剃去頭部毛發(fā),使用手術(shù)刀沿顱骨中鋒劃開頭皮,用止血鉗將頭皮撐開。用3%的過氧化氫溶液灼燒顱骨上的骨膜,直至清晰露出前囟位置。

    以前囟處為原點(diǎn),在顱骨上找到黑質(zhì)致密部對應(yīng)的點(diǎn)(前囪后5.2±0.1mm,矢狀縫左側(cè)2.5±0.1mm,顱骨表面下8.5±0.1mm)[4],用腦鉆鉆穿顱骨,將微透析探針導(dǎo)管置于黑質(zhì)致密部,向下深入7.5±0.1mm(減去探針的透析膜長度,本實(shí)驗(yàn)中為1mm)。在顱骨的其他部位再鉆兩個孔,旋入兩個小螺絲,使用自凝造牙粉將探針導(dǎo)管與螺絲一起固定住。

    2.1.2 微透析操作

    待大鼠創(chuàng)口恢復(fù)后,使用乙醚輕微麻醉,將微透析探針小心地插入探針導(dǎo)管中,然后將其置于清醒動物活動系統(tǒng)中。待其清醒后即可進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)。

    透析過程:0~2h,使用林格氏液(147 mM NaC1,2.3 mM CaCl2,4mM KC1, pH 6.0),2~5h,使用含有DA的林格氏液。

    透析液DA濃度梯度:10μM、100μM、1000μM。此時流速為2μL/min。

    透析速度梯度:0.5μL/min、1μL/min、2μL/min。此時DA濃度為1000μM。

    2.2 HPLC-ECD檢測透析液

    使用Discovery?HS F5柱,流動相為0.1M檸檬酸、0.2M Na2HPO4、0.3mM Na2EDTA,6%乙腈,pH 3.75,流速為0.8mL/min,進(jìn)樣量40μL。檢測器電勢-50、300、350、450mV (主通道350mV)。

    2.3 透析效率的計(jì)算

    3 結(jié)果

    3.1 不同DA濃度對透析效率的影響

    結(jié)果如圖1所示,透析液中DA濃度越大,透析效率越低。但是從總的透析量上來看,濃度越大能透過的DA量越大。

    3.2 不同透析速度對透析效率的影響

    結(jié)果如圖2所示,透析速度越低,透析效率越高。這是因?yàn)橥肝鏊俣冉档椭?,透析液在微透析探針的半透膜處停留的時間更長,從而更加有利于物質(zhì)的交換,使DA能夠透過更多[5]。

    圖1 不同多巴胺濃度對透析效率的影響

    圖2 不同透析速度對透析效率的影響

    4 結(jié)論

    通過本實(shí)驗(yàn),可以看出,微透析過程中的透析效率與透析液中的物質(zhì)濃度和透析速度有關(guān),濃度越小,速度越低,透析效率越高。但是物質(zhì)濃度降低之后,能夠透過的物質(zhì)總量也隨之減少,透析速度降低之后能夠,要灌注一定量的透析液所需的總時間也隨之增加,所以要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的物質(zhì)濃度與透析速度。

    [1]韓慧婉, 舒鴻鈞, 劉國詮. 微透析技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 化學(xué)通報(bào), 2000, 12:52-56

    [2]馮飛, 許崇濤. 微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用[J]. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 21(1):55-57

    [3]Giuseppe C, Marina M C, Addolorata S C. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2012,71:183-186

    [4]諸葛啟釧譯. 大鼠腦立體定位圖譜(第3版)[M], 北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.

    [5]關(guān)里, 趙金垣. 微透析技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 25(1):94-96

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