PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP酶表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究

劉冬娟 肖 冰 徐 盟 韓 芳3＊ 石玉秀，3＊

PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP酶表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究

劉冬娟1肖 冰1徐 盟2韓 芳3＊1石玉秀1，3＊2

（1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電子顯微學(xué)研究室；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)九十五期七年制；3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001）

目的 研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞T MP（三偏磷酸酶）活性分布及其表達(dá)變化。方法 采用SPS刺激方法，建立PTSD樣大鼠SPS模型，隨機(jī)分為SPS刺激后1d、7d、14d和正常對(duì)照組，應(yīng)用光、電鏡酶組化技術(shù)方法，分別對(duì)各組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞T MP活性分布及其變化進(jìn)行觀察和定量檢測(cè)。結(jié)果 光鏡下T MP酶反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為棕褐色顆粒分布于細(xì)胞質(zhì)中；電鏡下T MP酶反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為高電子密度的黑色顆粒沉淀，分布于各組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)溶酶體上。SPS刺激后1d、7d、14d中縫背核神經(jīng)元T MP活性表達(dá)比正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)，并于7d達(dá)到高峰。結(jié)論 創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞T MP活性增強(qiáng)，提示T MP參與了中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡產(chǎn)物的降解和處理過(guò)程。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；中縫背核；神經(jīng)元；T MP

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttrau matic stress disorder，PTSD）是指對(duì)災(zāi)難、戰(zhàn)爭(zhēng)、恐怖事件、交通意外、虐待等嚴(yán)重應(yīng)激因素的一種異常精神反應(yīng)［1］，也是應(yīng)激疾病中最為典型的一種［2］，出現(xiàn)創(chuàng)傷經(jīng)歷再體驗(yàn)、對(duì)有關(guān)創(chuàng)傷性情境的回避和情感麻木、警覺(jué)過(guò)度等癥狀［3］。其癥狀出現(xiàn)是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)激信息的記憶過(guò)程出現(xiàn)了障礙，使條件化的恐懼難以抑制或過(guò)分抑制所致。中縫背核（dorsal raphe nucleus）位于腦橋上部向上至中腦動(dòng)眼神經(jīng)核尾側(cè)部，在中央灰質(zhì)的腹側(cè)。中縫背核支配區(qū)較大［4］，其纖維投射十分廣泛與各腦區(qū)有著復(fù)雜的神經(jīng)纖維關(guān)系。有報(bào)道PTSD患者存在腦橋體積縮小及灰質(zhì)密度減少［5］，PTSD促進(jìn)大鼠中縫背核細(xì)胞色素C的釋放，提示PTSD樣大鼠中縫背核神經(jīng)元可能存在細(xì)胞凋亡［6］，致中縫背核功能異常。三偏磷酸酶（Thina mine monophosphatase，T MP）是溶酶體的標(biāo)志酶，也是溶酶體的蛋白水解酶［7］，T MP活性表達(dá)的變化可以表示溶酶體的功能狀態(tài)。SPS（single prolonged stress）動(dòng)物模型是目前探討PTSD的發(fā)病機(jī)制比較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｍㄟ^(guò)觀察應(yīng)激條件下三偏磷酸酶（Thina mine monophosphatase，T MP）活性表達(dá)的變化，探討PTSD樣大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP活性變化與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，旨在為揭示PTSD的發(fā)病機(jī)理奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

動(dòng)物：成年健康雄性 Wistar大鼠50只，體重150-180g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

主要試劑與儀器：氯化鈰和三偏磷酸酶均購(gòu)自sig ma公司；透射電鏡（JEOL JEM-1200EX，日本）。

2.方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康雄性Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，隨機(jī)分為4組，即無(wú)連續(xù)單一（single pr ol onged stress，SPS）刺激的正常對(duì)照組及SPS刺激組，其中SPS刺激后1d、7d和14d組為PTSD樣大鼠組。

2.2 建立PTSD樣大鼠SPS模型

該模型采用2005年日本文部省召開(kāi)的"基礎(chǔ)和臨床的研究進(jìn)展"的會(huì)議確定的關(guān)于PTSD模型-SPS刺激后無(wú)干擾喂養(yǎng)的方法。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理［8］，即：大鼠禁錮2 h后，立即強(qiáng)迫游泳20 min（水深40c m，水溫24±1°C）。經(jīng)過(guò)15 min的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識(shí)喪失，在籠子中不再給予任何刺激，常規(guī)飼養(yǎng)直1d、7d和14d至取材。

2.3 酶組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方法

2.3.1 灌流取材

乙醚麻醉正常和SPS各組Wistar大鼠，再用2%戊巴比妥強(qiáng)化麻醉，用0.01 mol／L PBS配制的0.25%戊二醛與2%多聚甲醛的混合液心臟灌流固定，取各組Wistar大鼠腦于同種固定液中固定1 h，然后浸于 Holt，S溶液（40%蔗糖，0.1 mol／L PBS配制）中2-3d至沉下。

（1）在改革開(kāi)放和發(fā)展社會(huì)主義市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的條件下，思想意識(shí)出現(xiàn)了多元化的新特點(diǎn)，為精神文明建設(shè)帶來(lái)了新的契機(jī)，同時(shí)也帶來(lái)了諸多挑戰(zhàn)。主要表現(xiàn)在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)條件下拜金主義、利己主義和享樂(lè)主義思想的負(fù)面作用，導(dǎo)致人們過(guò)多看重物質(zhì)財(cái)富，忽視了精神追求，醫(yī)務(wù)工作者也難以獨(dú)善其身。

2.3.2 光鏡酶組織細(xì)胞化學(xué)染色

將大鼠腦從Holt，S溶液中取出，于恒冷箱冰凍切片機(jī)（Leica CM1900）中行冠狀切片，片厚10μm。孵育液配制：0.05 mol／L醋酸緩沖液20 ml（p H3.9）、氯化鈰35.405 mg（用4 ml DH2O調(diào)制）、三偏磷酸酶15.29g、蔗糖 2.5g、Triton X-100 0.000075 ml、DH2 O 26 ml、總量為50 ml最終p H3.9。將各組切片分別置于上述孵育液中，37℃振動(dòng)恒溫水浴箱中孵育80 min。雙蒸水充分漂洗，經(jīng)1%硫化胺顯色1 min，雙蒸水再次漂洗干凈，甘油明膠封片，根據(jù)鼠腦圖譜［9］光鏡鏡檢定位中縫背核、攝片。

2.3.3 電鏡酶組織細(xì)胞化學(xué)染色

將大鼠腦中縫背核組織塊從30%蔗糖溶液中取出，于恒冷箱冰凍切片機(jī)（Leica CM1900）中行冠狀切片，片厚20μm 經(jīng)0.01 mol／L PBS漂洗后，將各組切片分別置于上述孵育液中，37℃振動(dòng)恒溫水浴箱中孵育80 min。切片經(jīng)0.01 mol／L PBS漂洗，1%鋨酸后固定，常規(guī)透射電鏡樣品制備，根據(jù)鼠腦圖譜光鏡下定位中縫背核、超薄切片厚70n m，醋酸鈾染色，于JEM-1200EX透射電鏡下觀察、攝片。

3.圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組隨機(jī)抽取光鏡酶組織細(xì)胞化學(xué)染色切片8張，每張測(cè)5個(gè)視野，利用LUZEXF圖像分析系統(tǒng)，測(cè)T MP酶反應(yīng)強(qiáng)度的平均光密度值。將所得圖像分析數(shù)據(jù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)用SPSS13.0軟件包處理，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.中縫背核神經(jīng)元光鏡TMP酶組化反應(yīng)的變化

表1 各組大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP酶組化反應(yīng)OD值比較（ˉx±s）Table 1 The average of OD val ue of T MP enzy me histochemistry reaction in Dorsal raphe neuron of rats in each group（ˉx±s）

2.中縫背核神經(jīng)元電鏡TMP酶組化反應(yīng)的變化

正常對(duì)照組（圖2 A）及SPS1d、7d和14d（圖2B、C、D）大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為高電子密度的顆粒，分布于胞質(zhì)內(nèi)溶酶體上。正常對(duì)照組大鼠中縫背核神經(jīng)元T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒電子密度較高；SPS1d、7d和14d溶酶體上T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒電子密度與正常對(duì)照組相比均有所增高，溶酶體膜性結(jié)構(gòu)局部破損（圖2B、C、D），并有部分反應(yīng)顆粒向胞質(zhì)內(nèi)溢出。其中SPS7d胞質(zhì)內(nèi)溶酶體上T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒電子密度更高、反應(yīng)顆粒向胞質(zhì)內(nèi)溢出更明顯（圖2C）

討 論

近年來(lái)PTSD發(fā)病和患病率高、慢性病程、療效差等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響創(chuàng)傷救治而備受關(guān)注［10］。中縫背核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的主要組成部分，具有廣泛的纖維聯(lián)系，其傳出的部分投射纖維刺激中縫大核可使痛閾升高［11］，中縫背核在傷害性刺激中具有主要調(diào)節(jié)作用，中縫背核功能失調(diào)與PTSD的發(fā)病有一定關(guān)系。有研究報(bào)道，PTSD患者腦橋存在體積縮小和灰質(zhì)密度減少［5］，中縫背核神經(jīng)元可能存在細(xì)胞凋亡［6］，那么中縫背核神經(jīng)元T MP活性表達(dá)是否有變化并與細(xì)胞凋亡是否有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠SPS模型，應(yīng)用光、電鏡酶組化技術(shù)來(lái)檢測(cè)正常組和SPS組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞T MP活性表達(dá)的變化。溶酶體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)的外源性異物及內(nèi)源性殘余物，以保護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。T MP酶是溶酶體的蛋白水解酶之一，也是溶酶體的標(biāo)志酶，T MP酶表達(dá)的變化可以表示溶酶體的功能狀態(tài)，細(xì)胞凋亡產(chǎn)物需要溶酶體酸性水解酶的處理。有實(shí)驗(yàn)表明［12］，凋亡細(xì)胞經(jīng)歷的和細(xì)胞光解損傷后經(jīng)歷的階段極為相似，即溶酶體膜通透性增大，蛋白水解酶和蛋白激酶從中釋放。使細(xì)胞變性、壞死過(guò)程進(jìn)而加速，以清除凋亡的細(xì)胞。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，與正常對(duì)照組相比較，光鏡下SPS1d、SPS7d和SPS14d各組中縫背核神經(jīng)元T MP的活性均增強(qiáng)；電鏡下SPS1d、SPS7d和SPS14d各組中縫背核神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)溶酶體上T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒的電子密度均有增加，溶酶體膜有部分破損，T MP酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒向胞質(zhì)內(nèi)溢出，尤以7d最為明顯。說(shuō)明SPS后大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞可能受到了凋亡刺激，使得溶酶體膜變得不穩(wěn)定，其滲透性發(fā)生了改變，底物可以滲入，T MP酶活性增強(qiáng)是中縫背核神經(jīng)元處理凋亡產(chǎn)物的代償，應(yīng)激增加了中縫背核神經(jīng)元的凋亡。提示溶酶體內(nèi)TPM酶溢出釋放到了細(xì)胞質(zhì)中參與了細(xì)胞凋亡產(chǎn)物的降解和處理過(guò)程，TPM酶的增加有利于凋亡產(chǎn)物的清除。溶酶體吞噬消化細(xì)胞凋亡產(chǎn)物，致使中縫背核神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，可能引起腦橋體積變小，致使中縫背核的功能障礙。

總之，研究結(jié)果表明創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞TMP酶表達(dá)上調(diào)，提示TMP酶可能參與了PTSD樣大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡產(chǎn)物的降解與處理。中縫背核細(xì)胞凋亡，可能是導(dǎo)致PTSD患者腦橋存在體積縮小和灰質(zhì)密度減少的原因和情感行為異常的重要病理生物學(xué)基礎(chǔ)之一。

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Experi mental study on changes of TMP activity in dorsal raphe nucleus neurons of PTSD rats by light and electron microscopy

Liu Dongj uan1，Xiao Bing1，Xu Meng2，Han Fang3＊1，Shi Yuxiu1，3＊2
（1Depart ment of Electron Microscop y，College of Basic Medical Sciences，China Medical University；295 K Seven-Year System ，China Medical University；3Depart ment of Histology and Embr yology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To study the expression and distribution of T MP activity in the dorsal raphe nucleus of PTSD （posttrau matic stress disor der）rats.Met hods The SPS-method was used to set up t he rat PTSD models.Rats were rando mly divided into 1d，7d and 14d gr oups of SPS and the nor mal group.The changes of T MP activity and distribution of T MP in the dorsal raphe nucleus was detected by light micr oscopy and trans mission electr on micr oscopy（TEM）.Results T MP was widel y distributed t hr oughout the dorsal raphe nucleus region，mainly in the cytoplas m，appearing as buff y particles.Positive expression of T MP，highl y electron-dense black granules，was l ocated in l ysoso mes of all gr oups.Eval uation of T MP by enzy mohistoche mistr y indicated a significant increase in t he SPS model gr oups co mpared wit h t he normal control group（P＜0.05），which peaked in the SPS 7d group（P＜0.05）.Conclusion The expression of T MP significantly increases after SPS sti mulation in t he dorsal raphe neur ons of PTSD rats，which may indicate that T MP is involved in degradation and processing of the apoptotic products in the dorsal raphe nucleus.

Posttrau matic stress disor der；Dorsal raphe nucleus；Neur on；Thina mine monophosphatase

R322.81

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.004

2011-12-18

2012-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（31140060，81171282）；國(guó)家教育部博士點(diǎn)基金資助（20092104110016）

劉冬娟，女（1962年），漢族，副主任技師。

＊通訊作者（To who m correspondence should be addressed）