基于RAPD標(biāo)記的南蒼術(shù)居群遺傳多樣性分析

郭建林，葛燕芬，孫小芹，李密密，夏 冰，杭悅宇

〔江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014〕

中國傳統(tǒng)中藥材蒼術(shù)為菊科(Compostiae)蒼術(shù)屬(Atractylodes DC.)植物南蒼術(shù)〔A.lancea(Thunb.)DC.〕和北蒼術(shù)〔A.chinensis(DC.)Koidz.〕的干燥根［1］。迄今為止，對(duì)蒼術(shù)原植物的分類處理仍有一定的爭(zhēng)議?！吨袊叩戎参飯D鑒》［2］將藥材蒼術(shù)的原植物定為南蒼術(shù)和北蒼術(shù);而《中國植物志》［3］和《Flora of China》［4］則將南蒼術(shù)和北蒼術(shù)合并為蒼術(shù)〔A.lancea(Thunb.)DC.〕。

南蒼術(shù)又稱茅蒼術(shù)，主要分布于江蘇、浙江、安徽和湖北等狹小區(qū)域內(nèi)，傳統(tǒng)認(rèn)為江蘇茅山地區(qū)為南蒼術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)。由于沒有進(jìn)行規(guī)模性栽培，南蒼術(shù)的野生資源遭到掠奪式采挖，使得南蒼術(shù)特別是茅山的南蒼術(shù)野生資源瀕臨枯竭［5］。因而，有研究者建議將野生茅蒼術(shù)列入珍稀瀕危保護(hù)植物名錄中［6］。

已有研究表明:道地與非道地南蒼術(shù)在揮發(fā)油含量及組成上有明顯不同，江蘇分布的南蒼術(shù)揮發(fā)油的主成分是蒼術(shù)酮和蒼術(shù)素，而湖北分布的南蒼術(shù)揮發(fā)油的主成分則是蒼術(shù)醇和 β－桉葉醇［7－11］;王鳴等［12］的研究結(jié)果顯示:江蘇產(chǎn)南蒼術(shù)水溶性成分中主要含有蒼術(shù)苷A，與湖北產(chǎn)茅蒼術(shù)水溶性成分中的主成分有一定差異;但張貝貝等［13］綜合考慮南蒼術(shù)中蒼術(shù)素、β－桉葉醇、蒼術(shù)素醇和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量指標(biāo)，認(rèn)為主產(chǎn)地南蒼術(shù)的質(zhì)量?jī)?yōu)于道地產(chǎn)區(qū)。為明確蒼術(shù)的遺傳變異狀況，任冰如等［14］采用RAPD標(biāo)記對(duì)10個(gè)蒼術(shù)居群的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示供試的7個(gè)南蒼術(shù)居群和3個(gè)北蒼術(shù)居群均具有較近的遺傳關(guān)系，南蒼術(shù)和北蒼術(shù)之間的差異較小，支持將北蒼術(shù)定為變種;郭蘭萍等［15］也采用RAPD方法對(duì)南蒼術(shù)和北蒼術(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明蒼術(shù)的化學(xué)成分和遺傳分化與其地理分布均有一定的相關(guān)性，以地域?yàn)榻鐒澐帜仙n術(shù)和北蒼術(shù)有一定的道理。由此可見，不同產(chǎn)地南蒼術(shù)的有效成分均具有一定的變異，其藥材質(zhì)量與產(chǎn)地存在一定的相關(guān)性，對(duì)其藥材道地性的確認(rèn)難以有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)中藥蒼術(shù)原植物分類地位的確認(rèn)仍較為混亂。

為了進(jìn)一步明確蒼術(shù)種下遺傳變異狀況，了解不同產(chǎn)地南蒼術(shù)的遺傳差異，作者利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)南蒼術(shù)主要分布區(qū)(包括江蘇、湖北和安徽)7個(gè)野生居群的遺傳多樣性和遺傳分化水平進(jìn)行了比較，并采用聚類分析法對(duì)居群的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為中藥蒼術(shù)原植物的確定及其藥材道地性的研究提供分子水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2003年11月、2006年4月和6月分別在湖北、江蘇和安徽7個(gè)南蒼術(shù)野生居群中確定28個(gè)樣株，樣株間距離不小于20 m;分別采集每一樣株的新鮮幼嫩葉片，用硅膠快速干燥后常溫密封保存、待用。采集樣品均經(jīng)江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所杭悅宇研究員鑒定，基本采集信息見表1。

DNA純化回收試劑盒購自北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所;RAPD引物由上海Invitrogen生物技術(shù)公司合成;10×PCR buffer(含Mg2+)、dNTPs和 Taq DNA 聚合酶均購自上海申能博彩生物科技有限公司;100 bp DNA ladder為Fermentas公司產(chǎn)品。使用的主要儀器有PE－9600型PCR擴(kuò)增儀(美國Perkin Elmer公司)和WV－BP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 提取及純化 參照 Paterson等［16］的CTAB法提取基因組總DNA，并加以改進(jìn)。取1～3 g葉片，置入液氮中研磨至粉末狀，加入65℃提取緩沖液650 μL，65℃溫育1 h，期間每隔10 min輕輕搖晃1次;加入V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1混合液650 μL，輕輕顛倒搖晃后于室溫下靜置5～10 min;于4℃、12 000 r·min－1離心12 min，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，于－20℃冰箱中放置2 h;4℃、12 000 r·min－1離心 12 min，取沉淀;用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀，于4℃、12 000 r·min－1離心5 min，棄上清液，DNA沉淀自然風(fēng)干;將獲得的DNA粗樣用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行純化后溶解于無菌雙蒸水中，－20℃貯藏、備用。1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè) 以江蘇湖山居群3個(gè)單株的基因組總DNA為模板進(jìn)行RAPD引物篩選，從80條RAPD引物中選取18條擴(kuò)增條帶豐富、信號(hào)強(qiáng)且穩(wěn)定性高的引物對(duì)所有單株的基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 供試南蒼術(shù)7個(gè)居群的基本采集信息Table 1 Basic collection information of seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.tested

PCR反應(yīng)在PE－9600型 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括模板 DNA 30 ng、10×PCR buffer(含 Mg2+)2.0 μL、10 mmol·L－1dNTPs 0.3 μL、5 μmol·L－1引物 2.0 μL 和 5 U·μL－1Taq DNA聚合酶 0.2 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 20 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，38 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共 38 個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物置于4℃保存。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·mL－11×EB)電泳 1.5 h，用 WVBP330型凝膠掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。電泳時(shí)以100 bp DNA ladder作為分子量標(biāo)記。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將重復(fù)性好、清晰且遷移率相同的條帶作為同源位點(diǎn)進(jìn)行處理，有條帶的位點(diǎn)記為“1”、無條帶的位點(diǎn)記為“0”，轉(zhuǎn)化為二元數(shù)據(jù)矩陣;應(yīng)用 POPGENE v1.31軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、基因分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm);采用UPGMA法對(duì)7個(gè)居群28個(gè)單株間的遺傳關(guān)系進(jìn)行聚類分析;居群內(nèi)單株間和地區(qū)間、居群間的變異通過DCFA 1.1軟件和AMOVA法進(jìn)行計(jì)算［17］。

2 結(jié)果和分析

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果分析

利用篩選出的18條RAPD引物、以南蒼術(shù)7個(gè)居群28個(gè)單株的基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果詳見表2。由表2可見:引物E－04擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，僅有4條，且沒有擴(kuò)增出多態(tài)性條帶;引物AB－05和B－08擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，達(dá)到15條，且引物B－08擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，達(dá)到13條;引物AH－15擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率最高，達(dá)到90.00%。28個(gè)單株18條引物共擴(kuò)增出193條重復(fù)性好且清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶有111條;平均每條引物擴(kuò)增出10.72條帶，其中多態(tài)性條帶6.17條;多態(tài)性條帶百分率的平均值為57.51%，表明南蒼術(shù)種內(nèi)遺傳多樣性及遺傳變異程度較低。

表2 用于南蒼術(shù)RAPD－PCR反應(yīng)的引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果1)Table 2 Primersequencesused forRAPD-PCR reaction of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.and their amplification results1)

2.2 居群遺傳多樣性分析

南蒼術(shù)7個(gè)居群的遺傳多樣性指數(shù)見表3。結(jié)果表明:從省級(jí)水平看，多態(tài)性條帶百分率最高的為江蘇(45.60%)，湖北次之(44.04%)、安徽(19.17%)最低;而有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)均為湖北最高、江蘇次之、安徽最低。從居群水平看(蕪湖居群只有1個(gè)單株，無法計(jì)算各指標(biāo)，因此不進(jìn)行統(tǒng)計(jì))，各居群多態(tài)性條帶百分率由高到低依次排序?yàn)楹北？?、湖北英山、江蘇小九華山和湖山、江蘇小湯山、安徽金寨，而各居群有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)由高到低則均依次排序?yàn)楹北？怠⒑庇⑸?、江蘇湖山、江蘇小九華山、江蘇小湯山、安徽金寨。從7個(gè)居群的總水平看，南蒼術(shù)的多態(tài)性條帶百分率、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)分別為 57.51%、1.317 4、0.187 2 和 0.282 7，表明南蒼術(shù)居群間的遺傳多樣性水平較低。

表3 南蒼術(shù)7個(gè)居群的遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.

2.3 居群間的聚類分析

基于RAPD標(biāo)記分析結(jié)果獲得的南蒼術(shù)7個(gè)居群的遺傳距離見表4。由表4可見:7個(gè)居群間的遺傳距離為0.150 7～0.252 1，其中，安徽金寨和安徽蕪湖2個(gè)居群間的遺傳距離最小，僅為0.150 7;江蘇湖山和安徽蕪湖2個(gè)居群間的遺傳距離大，為0.252 1。

基于RAPD擴(kuò)增結(jié)果，應(yīng)用POPGENE v1.31軟件對(duì)7個(gè)居群28個(gè)南蒼術(shù)單株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。聚類分析結(jié)果表明:來自同一個(gè)居群的單株均聚在一起，表明南蒼術(shù)同一居群?jiǎn)沃觊g的遺傳變異較小，遺傳背景相似。根據(jù)聚類結(jié)果，7個(gè)居群首先可分為2組:第1組僅有湖北?？稻尤海@示湖北?？稻尤号c其他居群間有較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系;第2組包含其余的6個(gè)居群，其中，安徽蕪湖居群的1個(gè)單株與安徽金寨居群聚在一起，表明它們之間可能具有較近的遺傳關(guān)系;湖北英山居群與江蘇小九華山居群首先聚在一起，隨后依次與江蘇小湯山、安徽金寨居群聚類，最后才與江蘇湖山居群聚在一起，表明江蘇湖山居群與江蘇其他2個(gè)居群具有一定的遺傳距離，而湖北英山居群與江蘇小九華山居群具有較近的遺傳關(guān)系，由此看出7個(gè)居群的聚類結(jié)果與居群的地理分布無明顯關(guān)系。

表4 基于RAPD標(biāo)記分析的南蒼術(shù)7個(gè)居群的遺傳距離1)Table 4 Genetic distance among seven populations of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.based on RAPD marker analysis1)

圖1 基于Nei’s遺傳距離的南蒼術(shù)7個(gè)居群28個(gè)單株的聚類圖Fig.1 Cluster dendrogram of 28 individuals of Atractylodes lancea(Thunb.)DC.from seven populations based on Nei’s genetic distance

2.4 居群間的遺傳分化分析

采用AMOVA法對(duì)供試南蒼術(shù)7個(gè)居群進(jìn)行遺傳變異方差分析，結(jié)果表明:地區(qū)間、地區(qū)內(nèi)居群間及居群內(nèi)的變異分別占總變異的8.39%、29.88%和61.74%。而用POPGENE v1.31軟件計(jì)算出的基因分化系數(shù)(Gst)為0.206 5，即7個(gè)居群總的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)(79.35%)，總變異的20.65%來自居群間，比AMOVA法的分析結(jié)果略低。基因流(Nm)為1.921 5，說明供試南蒼術(shù)7個(gè)居群間沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。

3 討 論

聚類分析結(jié)果顯示:位于湖北西部羅田地區(qū)的?？稻尤?jiǎn)为?dú)成組，說明該居群的遺傳分化較其他居群明顯;而屬于大別山區(qū)的湖北英山和安徽金寨居群與屬于茅山地區(qū)的江蘇小九華山、江蘇小湯山和江蘇湖山居群聚為一組，表明后5個(gè)居群遺傳關(guān)系較近。這一結(jié)果與郭蘭萍等［18］的“湖北房縣與江蘇句容的南蒼術(shù)居群聚為一類”的研究結(jié)論相近，但與任冰如等［14］的“大別山區(qū)英山居群與其他各居群的遺傳距離最大”的結(jié)論有較大差異。南蒼術(shù)是一個(gè)外部形態(tài)多變且受地理－氣候環(huán)境影響很大的類群，有很多過渡類型，例如，胡世林等［19］報(bào)道了在大別山區(qū)鄰近的湖北羅田有1個(gè)穩(wěn)定的種下變異類群，定名為羅田蒼術(shù)(Atractylodes lancea subsp.luotlanensis Hu et Feng);彭華勝等［20］也認(rèn)為大別山區(qū)外緣的低山地區(qū)(如桐城等地)分布的是典型的南蒼術(shù)的原形態(tài)類型，而在安徽潛山、舒城、岳西和金寨等地則分布著南蒼術(shù)和羅田蒼術(shù)的過渡類型。而從本研究結(jié)果看，湖北?？稻尤阂才c其他居群有較大的遺傳距離，存在種下變異的可能，其與其他居群的分類關(guān)系有待確定。

Bussell［21］基于 RAPD 數(shù)據(jù)分析了 35 種植物(其中29個(gè)為異交植物)的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明:異交植物基因分化系數(shù)(Gst)的平均值為0.193，6種自交植物Gst的平均值為0.625。本研究中，各居群間的遺傳變異并不大，Gst為0.206 5，略高于異交植物Gst的平均值，但遠(yuǎn)低于自交植物 Gst的平均值(0.59)［22］。Hogbin等［23］認(rèn)為:異交物種的遺傳變異大多分布在群體內(nèi)，群體間的遺傳變異通常占27%以下。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

基因流(Nm)對(duì)居群內(nèi)遺傳變異的分化有重要影響，具有有限基因流的物種其遺傳分化往往大于那些具有廣泛基因流的物種。一般認(rèn)為:Nm大于1，說明基因流能抑制居群內(nèi)遺傳漂變的作用，防止居群分化;Nm小于1，說明遺傳漂變可導(dǎo)致居群明顯的遺傳分化［24－25］。南蒼術(shù) 7 個(gè)居群的 Nm為 1.921 5，遠(yuǎn)低于異交和風(fēng)媒植物 Nm的平均水平(5.380)［26］，但略高于一般廣布種的 Nm水平 (1.881)［27］。按照Slatkin［24］和 Hamrick 等［26］的觀點(diǎn)，若每代遷入個(gè)體數(shù)的Nm大于1，說明基因流足以抵制遺傳漂變的作用，同時(shí)也可防止居群分化的發(fā)生。在植物中，基因流是借助花粉、種子、孢子、植株個(gè)體以及其他攜有遺傳物質(zhì)的物體為媒介進(jìn)行的，其中花粉和種子的擴(kuò)散是2種最主要的形式［28］。蒼術(shù)是自交不親和植物，主要靠昆蟲傳粉，異花授粉的結(jié)實(shí)率約為60%，且果實(shí)結(jié)實(shí)率受蟲害及天氣的影響很大，危害率達(dá)80%～90%，種子壽命僅為1 ～2 d［29－31］，因此，南蒼術(shù)居群間通過花粉與種子進(jìn)行基因交流的概率比較小，這也是居群間遺傳分化不大的原因之一。

綜上所述，7個(gè)南蒼術(shù)居群整體的遺傳多樣性水平偏低，居群間遺傳分化不大，但由于它們?cè)谏飳W(xué)特性及次生代謝產(chǎn)物組成上存在一定的差異，因而，建議可根據(jù)各居群主要成分的藥理作用選擇使用。

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