IL-13基因多態(tài)性位點(diǎn)rs20541和rs1800925單核苷酸多態(tài)性與兒童支氣管哮喘關(guān)聯(lián)性的研究

舒 磊 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 杭州 310003

支氣管哮喘（asthma）是兒童最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)變態(tài)反應(yīng)性疾病，是由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的氣道急、慢性疾病，多為過(guò)敏性炎癥。2003年中國(guó)大陸13～14歲兒童中自覺(jué)有喘息癥狀的患病率大約為4%[1]。呼吸道的急性炎癥可使氣道管壁血管通透性增加、黏液分泌增多、平滑肌痙攣；而慢性炎癥可進(jìn)一步改變氣道結(jié)構(gòu)和功能，致使氣道高反應(yīng)性，引起喘息、咳嗽和呼吸困難等癥狀[2]。全世界早已達(dá)成共識(shí)，哮喘是由遺傳、環(huán)境以及其他因素共同作用而引起的一種多基因、復(fù)雜性遺傳病，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性[3]。迄今，科學(xué)家們已運(yùn)用了各種方法，包括家系連鎖關(guān)聯(lián)分析、全基因組微衛(wèi)星連鎖分析、全基因組單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）掃描、綜合分析（meta-analysis）等，以求揭示哮喘的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。截止目前，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)基因可能與哮喘的發(fā)生相關(guān)，所涉及的染色體區(qū)域包括 2p16、2p25、2q33、5q31-q33、7p14-p15、7q21、11q12-q13、12q24、14q24、19p13、20p12、20p13和20q13等[3]。我們研究了在哮喘發(fā)病中具有重要作用的IL-13基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)：位于第4外顯子編碼區(qū)的rs20541和位于基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域的rs1800925的基因型頻率分布特點(diǎn)及其多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本組哮喘患者105例，男65例，女40例，年齡4～15歲，平均9.5歲；所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并仔細(xì)詢問(wèn)既往史、家族過(guò)敏史。其中具有家族史38例（男21例，女17例）。同時(shí)以近2周內(nèi)無(wú)呼吸道感染癥狀，本人及三代以內(nèi)的直系親屬無(wú)過(guò)敏史且既往無(wú)哮喘及反復(fù)呼吸道感染病史的112名健康漢族兒童為對(duì)照組，男58名，女54名，年齡4～16歲，平均8.3歲。

1.2 方 法 樣本DNA提取 ①一次性抽取外周血5mL，以EDTA抗凝，用TIANamp Blood DNA Kit（北京天根生物工程公司）常規(guī)提純基因組DNA。②用全基因組DNA分別擴(kuò)增含有rs20541和rs1800925兩個(gè)位點(diǎn)的DNA片段。PCR引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

PCR反應(yīng)體系總體積50μL，其中包括引物各15pmol，1U Taq DNA 聚合酶，2.5mmol/LMgCl2，200 mmol/L dNTP和模板DNA 0.5μg。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ lmin，95℃ lmin，60℃ 1min，72℃ lmin，共30個(gè)循環(huán)；延伸72℃5min（擴(kuò)增儀為GeneAmp PCR System 9700）。③rs20541的擴(kuò)增片段經(jīng)純化后在ABIPRISM 3100型DNA全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行直接測(cè)序分析（由大上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成）。以AS-PCR法分析SNP rs1800925。并隨機(jī)抽取部分樣本進(jìn)行DNA直接測(cè)序，以保證基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 rs20541基因型與哮喘發(fā)病的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，哮喘組和正常對(duì)照組的IL-13 Arg130Gln（rs20541）基因型和等位基因的頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 rs1800925基因型與哮喘的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，哮喘組和正常對(duì)照組的IL-13C-1111T（rs1800925）基因型和等位基因的頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表2 兩組IL-13基因rs20541位點(diǎn)的等位基因頻率分布 例（%）

表3 兩組IL-13基因rs1800925位點(diǎn)的等位基因頻率分布 例（%）

3 討論

白細(xì)胞介素-13基因是（interleukin13，IL-13）位于人類染色體5q31，全長(zhǎng)9937 bp，含有4個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄片段長(zhǎng)1283 bp，編碼含146個(gè)氨基酸殘基的IL-13細(xì)胞因子[4]。IL-13基因?yàn)榧?xì)胞因子基因家族成員，與IL-3、IL-5、IL-4以及CSF2簇集位于5q上。這些基因的結(jié)構(gòu)相似，在5q23-q31區(qū)域上的排布順序 為 ：cen-IL-3-CSF2-IL-13-IL-4- IL-5--tel。IL-13促使CD23在B細(xì)胞上表達(dá)，增強(qiáng)CD72和MHC II抗原的表達(dá)，促進(jìn)IgE重鏈基因在B細(xì)胞上轉(zhuǎn)錄[5]。Zhu等[6]的研究表明，IL-13與酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶（acidicmammalian chitinase）介導(dǎo)的通路，在哮喘動(dòng)物模型和哮喘患者的組織中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相關(guān)性。已經(jīng)完成的多項(xiàng)研究顯示，哮喘患者的氣道中存在IL-13分子，IL-13可介導(dǎo)哮喘的多個(gè)主要特征（包括氣道的高反應(yīng)性、黏膜上皮化生、氣道成纖維細(xì)胞的活化和增殖等），故IL-13基因與哮喘的診斷和治療息息相關(guān)。

IL-13基因上存在不少的SNP位點(diǎn)，在哮喘患者中呈現(xiàn)強(qiáng)烈的連鎖不平衡，如位于第3內(nèi)含子中的+1923C→T，位 于 第 4外 顯 子 中 的 +2044G→A（rs20541），位于3'非翻譯區(qū)的+2525G→A、+2580C→A 和+2749C→T，位 于 啟 動(dòng) 子 中 的-1512A→C（rs1881457）和-1112C→T（rs1800925）等[5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，IL-13的SNP 位點(diǎn)+2044G→A（rs20541）分別與血清IgE水平升高、嗜酸粒細(xì)胞增多、哮喘、過(guò)敏性皮炎和變應(yīng)原皮試陽(yáng)性等呈正相關(guān)[7]，而SNP位點(diǎn)-1112C→T（rs1800925）則分別與哮喘、氣道高反應(yīng)性和變應(yīng)原皮試陽(yáng)性、IgE水平、食物過(guò)敏等相關(guān)聯(lián)[8]。

近5年來(lái)，全世界對(duì)哮喘與IL-13基因型相關(guān)性研究較多。Wu等[9]對(duì)252名中國(guó)中部地區(qū)哮喘患兒進(jìn)行基因分型后發(fā)現(xiàn)，rs20541這個(gè)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的哮喘相關(guān)性，+2044A這種基因型為哮喘的遺傳相關(guān)性。在亞洲地區(qū)，香港、日本、韓國(guó)等地區(qū)的學(xué)者分別對(duì)300名以上哮喘患兒進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)+2044G→A（rs20541）和-1112C→T（rs1800925）位點(diǎn)與哮喘遺傳性具有強(qiáng)烈的相關(guān)性[9-10]。

在本研究中，兩組+2044G→A（rs20541）基因型頻率分布表現(xiàn)出顯著差異。而-1112C→T（rs1800925）的基因型頻率分布無(wú)顯著差異。本研究的患者均來(lái)自于中國(guó)浙江地區(qū)，而且研究的樣本數(shù)又相對(duì)偏小，所以研究結(jié)果與以前文獻(xiàn)報(bào)道可能會(huì)存在有一些差異。

［1］MasoliM，F(xiàn)abian D，Holt S，etal.The globalburden ofasthma:executive summary of the GINA Dissemination Committee report［J］.Allergy，2004，59（5）:469-478.

［2］Tattersfield AE，Knox AJ，Britton JR，etal.Asthma［J］.Lancet，2002，360（9342）:1313-1322.

［3］London SJ，Romieu I.Gene by environment interaction in asthma［J］.Annu Rev Public Health，2009，30:55-80.

［4］McKenzie AN，Culpepper JA，deWaalMalefytR，etal.Interleukin 13，a T-cell-derived cytokine that regulates human monocyte and B-cell function［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1993，90（8）:3735-3739.

［5］Punnonen J，Aversa G，Cocks BG，et al.Interleukin 13 induces interleukin 4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1993，90（8）:3730-3734.

［6］Zhu Z，Zheng T，Homer RJ，etal.Acidicmammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation［J］.Science，2004，304（5677）:1678-1682.

［7］Hunninghake GM，Soto-Quiros ME，Avila L，etal.Polymorphisms in IL-13，total IgE，eosinophilia，and asthma exacerbations in childhood［J］.JAllergy Clin Immunol，2007，120（1）:84-90.

［8］Liu X，Nickel R，Beyer K，et al.An IL-13 coding region variant is associated with a high total serum IgE level and atopic dermatitis in the German multicenter atopy study（MAS-90）［J］.JAllergy Clin Immunol，2000，106（1Pt1）:167-170.

［9］Wu X，Li Y，Chen Q，etal.Association and gene-gene interactions of eight common single-nucleotide polymorphisms with pediatric asthma in middle China［J］.JAsthma，2010，47（3）:238-244.

［10］Heinzmann A，Brugger M，Bierbaum S，et al.Joint influences of Acidic-Mammalian-Chitinase with Interleukin-4 and Toll-like receptor-10 with Interleukin-13 in the genetics of asthma［J］.Pediatr Allergy Immunol，2010，21（4 Pt2）:e679-e686.