堿性螺旋－環(huán)－螺旋轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控作用△

黃 倞 胡 芳 易敬林

哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜由于其明確的層次結(jié)構(gòu)和固定的細(xì)胞排列，已成為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理想模型。其中，小鼠因?yàn)榕c人類基因組的高度相似性而應(yīng)用最為廣泛。小鼠視網(wǎng)膜由6種神經(jīng)元細(xì)胞即視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、視錐與視桿感光細(xì)胞以及一種Müller膠質(zhì)細(xì)胞組成。Turner等[1]發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)細(xì)胞均由具有多向分化潛能的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(retinal progenitor cells，RPC)按照固定的順序分化發(fā)育而來(lái)，并根據(jù)形態(tài)和功能的不同進(jìn)一步分化為眾多的細(xì)胞亞型。Masland[2]預(yù)計(jì)視網(wǎng)膜中的細(xì)胞亞型應(yīng)該有50種以上，目前已鑒定明確的細(xì)胞亞型有20多種。雖然這些神經(jīng)細(xì)胞及其亞型是如何由RPC分化而來(lái)的目前尚不清楚，但隨著小鼠轉(zhuǎn)基因和基因敲除(入)技術(shù)的發(fā)展，堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helixloop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及其亞型的分化發(fā)育和命運(yùn)選擇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Harris[3]、Livesey 等[4]和 Cepko 等[5]通過(guò)小鼠基因敲除和以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的基因異位表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)RPC向特定細(xì)胞類型的分化過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而bHLH轉(zhuǎn)錄因子在其中扮演著重要的角色。目前Ohsawa等[6]認(rèn)為bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)于視網(wǎng)膜發(fā)育的全過(guò)程，在RPC的增殖、分化，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)選擇及發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用，其中表達(dá)于視網(wǎng)膜發(fā)育早期的家族成員決定著RPC的分化方向，而表達(dá)于發(fā)育后期的家族成員則作用于已分化細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。本文將對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中對(duì)不同類型神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控作用加以綜述。

1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)維持RPC增殖狀態(tài)的調(diào)控作用

在視網(wǎng)膜發(fā)育早期，RPC處于不斷增殖狀態(tài)，為各類神經(jīng)細(xì)胞的分化發(fā)育提供足夠的細(xì)胞數(shù)量支持。Ohsawa等[6]發(fā)現(xiàn)從小鼠胚胎期第10.5天(embryonic day 10.5，E10.5)開(kāi)始，RPC 進(jìn)入分化狀態(tài)并按照固定順序逐漸分化發(fā)育為不同種類的神經(jīng)細(xì)胞，其中最先產(chǎn)生的是RGC，然后依次是無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、視錐細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞和視桿細(xì)胞，最后是Müller膠質(zhì)細(xì)胞。為了滿足發(fā)育過(guò)程中不同種類神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)RPC數(shù)量的需求，RPC在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中處在增殖和分化并存的狀態(tài)，并一直保持到小鼠出生之后。研究發(fā)現(xiàn)在維持RPC增殖和分化的動(dòng)態(tài)平衡中bHLH轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的作用，其家族成員Hes1、Hes3和Hes5是調(diào)控RPC增殖狀態(tài)的關(guān)鍵因子。Takatsuka 等[7]和 Lee 等[8]發(fā)現(xiàn)Hes1基因突變的小鼠胚胎在RPC增殖受到嚴(yán)重影響的同時(shí)，在視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他組織中出現(xiàn)大量異常的早熟神經(jīng)細(xì)胞，并且視網(wǎng)膜中固定的層次排列也因?yàn)槲捶只?xì)胞的發(fā)育異常而消失;Deneen等[9]研究發(fā)現(xiàn) Hes5的表達(dá)缺失將造成約40%的Müller膠質(zhì)細(xì)胞減少，由于Müller膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是RPC分化過(guò)程中對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的一種儲(chǔ)蓄過(guò)程，在必要的情況下Müller膠質(zhì)細(xì)胞可以發(fā)揮神經(jīng)干細(xì)胞的功能而再次分化，因此，在Hes5基因突變小鼠中Müller膠質(zhì)細(xì)胞的大量減少可以解讀為RPC增殖的嚴(yán)重不足。并且Hojo等[10]通過(guò)基因異位表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，Hes5的異位表達(dá)將顯著地促進(jìn)Müller膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生，再次印證了 Hes5對(duì)維持RPC增殖狀態(tài)的作用。Hatakeyama等[11]的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hes1、Hes5雙基因敲除小鼠表現(xiàn)出較兩者單獨(dú)敲除時(shí)更加嚴(yán)重的視網(wǎng)膜發(fā)育異常，包括視網(wǎng)膜血管和視神經(jīng)盤(pán)的缺失;同時(shí) Hirata等[12]發(fā)現(xiàn)Hes3在RPC中表達(dá)并抑制促 RPC分化基因如Mash1等的活性，以此抑制RPC分化而保持RPC的持續(xù)增殖狀態(tài)。由此可見(jiàn)，在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中多種bHLH轉(zhuǎn)錄因子共同參與RPC的增殖與分化過(guò)程，對(duì)維持RPC的增殖狀態(tài)起著重要作用。

2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)RGC分化發(fā)育的調(diào)控作用

RGC是視網(wǎng)膜中唯一的傳出神經(jīng)元，負(fù)責(zé)將感光細(xì)胞收集的視覺(jué)信息傳遞至視覺(jué)中樞。Hatakeyama等[13]發(fā)現(xiàn)小鼠 RGC由 RPC從 E11.5開(kāi)始分化而來(lái)，分化過(guò)程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子Math5是RGC細(xì)胞命運(yùn)選擇的關(guān)鍵調(diào)控因子。Math5在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育早期即存在表達(dá)，并在E11.5至E13.5達(dá)到高峰，此時(shí)也正是部分RPC分化為RGC的時(shí)期，Prasov等[14]研究證實(shí) Math5的表達(dá)水平將直接決定著RGC 的產(chǎn)生數(shù)量。Brown 等[15]和 Wang等[16]通過(guò)基因敲除研究發(fā)現(xiàn)Math5的表達(dá)缺失將造成RGC的數(shù)量較正常時(shí)減少超過(guò)80%。Feng等[17]通過(guò)細(xì)胞譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，損失的RGC中包括部分原本應(yīng)分化為RGC的RPC發(fā)生細(xì)胞命運(yùn)改變轉(zhuǎn)而分化為無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和感光細(xì)胞，說(shuō)明Math5的表達(dá)直接調(diào)控著RPC向RGC或是其他類型神經(jīng)細(xì)胞分化。Brzezinski等[18]雖然發(fā)現(xiàn)Math5的表達(dá)能促進(jìn)部分RPC向 RGC 方向分化，但 Liu 等[19]和 Prasov等[20]卻認(rèn)為Math5不足以單獨(dú)決定RGC的數(shù)量，因?yàn)镸ath5的異位表達(dá)和過(guò)度表達(dá)并不能直接促使更多的RGC產(chǎn)生，提示著Math5可能和其他基因共同組成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用于 RGC的分化發(fā)育過(guò)程。Liu等[19]和Yang等[21]發(fā)現(xiàn) POU同源結(jié)構(gòu)域基因 Brn3b是Math5的下游基因，廣泛表達(dá)于RGC中，并對(duì)RGC的正常存活和功能維持發(fā)揮著重要作用。Badea等[22]和 Chen 等[23]發(fā)現(xiàn)當(dāng) Brn3b 被特異性敲除時(shí)將表現(xiàn)出RGC數(shù)量顯著減少、軸突發(fā)育異常和瞳孔對(duì)光反射異常等表型。至此可在RGC發(fā)育過(guò)程中大致勾勒出Math5決定早期RPC向RGC方向分化，而B(niǎo)rn3b控制RGC正常發(fā)育至成熟的Math5-Brn3b調(diào)控通路。

3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控作用

視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞分布于視網(wǎng)膜內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)中，是視網(wǎng)膜重要的中間神經(jīng)元，根據(jù)其形態(tài)、功能和神經(jīng)遞質(zhì)的不同可進(jìn)一步分為眾多不同的細(xì)胞亞型。雖然無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及其亞型是如何由RPC分化而來(lái)目前尚未明確，但Hatakeyama等[24]和 Inoue等[25]研究發(fā)現(xiàn)在無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞生成早期，bHLH轉(zhuǎn)錄因子Math3和NeuroD在RPC中存在表達(dá)，當(dāng)Math3和NeuroD同時(shí)缺失時(shí)將造成無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞數(shù)量顯著減少，說(shuō)明Math3和NeuroD的正常表達(dá)對(duì)RPC分化為無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞尤為關(guān)鍵。雖然Math3和NeuroD的異位表達(dá)并不能促使無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞數(shù)量增加，但Math3和NeuroD與同源盒基因Pax6同時(shí)異位表達(dá)時(shí)能有效地促進(jìn)無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的產(chǎn)生，說(shuō)明bHLH轉(zhuǎn)錄因子與同源盒基因共同參與構(gòu)成了無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在進(jìn)一步關(guān)于無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞亞型的分化研究中，F(xiàn)eng等[26]發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLHb5是γ-氨基丁酸能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞正常分化的必要因素;Mo等[27]發(fā)現(xiàn)Barhl2的表達(dá)能有效的促進(jìn)甘氨酸能無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的產(chǎn)生;而Cherry等[28]發(fā)現(xiàn)NeuroD2表達(dá)于AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞中，并對(duì)AII無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的數(shù)量和軸突生長(zhǎng)起著重要調(diào)控作用。說(shuō)明bHLH轉(zhuǎn)錄因子是視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞及其亞型細(xì)胞命運(yùn)選擇過(guò)程中的重要調(diào)控因素。

4 bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控作用

視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞與無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞作為視網(wǎng)膜重要的中間神經(jīng)元，是連接感光細(xì)胞和RGC的紐帶，進(jìn)行著視覺(jué)信息的視網(wǎng)膜內(nèi)傳遞。在雙極細(xì)胞的分化發(fā)育研究中Hatakeyama等[24]發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子Mash1和Math3結(jié)合同源盒基因Chx10共同調(diào)控著雙極細(xì)胞的分化過(guò)程，其中Mash1和Math3的表達(dá)決定產(chǎn)生雙極細(xì)胞的數(shù)量，而Chx10的表達(dá)則使雙極細(xì)胞在INL中形成固定的排列，并且Mash1、Math3和Chx10的同時(shí)異位表達(dá)能有效地促進(jìn)雙極細(xì)胞的生成。可見(jiàn)與無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的分化過(guò)程相似，雙極細(xì)胞的分化過(guò)程也同樣受到bHLH轉(zhuǎn)錄因子和同源盒基因的共同調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞根據(jù)其所在視覺(jué)傳導(dǎo)通路的不同而分為不同細(xì)胞亞型，F(xiàn)eng 等[26]和 Bramblett等[29]分別發(fā)現(xiàn) bHLH 轉(zhuǎn)錄因子bHLHb5和bHLHb4分別表達(dá)于視錐雙極細(xì)胞和視桿雙極細(xì)胞亞型中，是這兩種雙極細(xì)胞亞型分化和發(fā)育的重要調(diào)控因素，對(duì)這兩種雙極細(xì)胞亞型的存活和功能維持起著關(guān)鍵作用。說(shuō)明bHLH轉(zhuǎn)錄因子在視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞及其亞型的分化選擇及發(fā)育成熟過(guò)程中具有重要地位。

5 bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)視網(wǎng)膜水平細(xì)胞和感光細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控作用

利用基因敲除技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜水平細(xì)胞和感光細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程中，由多種bHLH轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮著重要的作用，其中Akagi等[30]研究發(fā)現(xiàn) Ngn2、Math3和 NeuroD 的缺失將造成視網(wǎng)膜水平細(xì)胞的大量減少;而Mash1、Ngn2和Math3的缺失在造成視網(wǎng)膜水平細(xì)胞顯著減少的同時(shí)伴有RGC的明顯增加;當(dāng)Mash1、Math3和NeuroD被敲除時(shí)將造成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)量的明顯減少;且Conte等[31]發(fā)現(xiàn)NeuroD和同源盒基因Pax6相互作用，控制著感光細(xì)胞和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞間的命運(yùn)選擇及分化后的正常發(fā)育過(guò)程。說(shuō)明bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)對(duì)RPC分化時(shí)的視網(wǎng)膜水平細(xì)胞和感光細(xì)胞命運(yùn)選擇具有重要的調(diào)控作用。同時(shí)上述研究中還發(fā)現(xiàn)在bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)缺失的情況下均伴有Müller膠質(zhì)細(xì)胞的明顯增加，說(shuō)明bHLH轉(zhuǎn)錄因子是RPC向神經(jīng)元細(xì)胞或Müller膠質(zhì)細(xì)胞分化方向選擇過(guò)程中的關(guān)鍵決定因素。因此一個(gè)由多種bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員間相互作用，相互影響并結(jié)合同源盒基因所組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著視網(wǎng)膜水平細(xì)胞和感光細(xì)胞的分化、發(fā)育及存活過(guò)程。

綜上所述，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程受到多種因素的影響，其中bHLH轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞分化、命運(yùn)選擇和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。從早期RPC增殖與分化的數(shù)量平衡控制，到RPC分化時(shí)的細(xì)胞命運(yùn)選擇，以及在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化完成后維持RPC未分化狀態(tài)而生成Müller膠質(zhì)細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子均發(fā)揮著重要的作用。目前眼科臨床工作中對(duì)于如年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼和視網(wǎng)膜色素變性等視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變性性疾病，只能通過(guò)治療來(lái)預(yù)防或延緩病情的發(fā)展，但無(wú)法恢復(fù)已損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量?；蛑委?、干細(xì)胞移植和視網(wǎng)膜移植已成為此類疾病治療中新的研究熱點(diǎn)，隨著對(duì)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能的深入研究和干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，Ong等[32]認(rèn)為通過(guò)在多能干細(xì)胞(如RPC)中引入分化調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子而誘導(dǎo)其定向分化成所需的神經(jīng)細(xì)胞類型已成為可能。目前Haruta等[33]已成功在由虹膜提取的神經(jīng)干細(xì)胞中引入特定轉(zhuǎn)錄因子而誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜感光細(xì)胞;Ooto等[34]在具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的Müller膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子而成功誘導(dǎo)出視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞。Nakano等[35]通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的人類胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)出了人類視網(wǎng)膜組織，得到的視網(wǎng)膜與由小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)得到的視網(wǎng)膜相比更接近人類視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，具有完整的視盤(pán)和明顯的層次排列，且視網(wǎng)膜中同時(shí)具有視錐和視桿兩種感光細(xì)胞，具有成為臨床視網(wǎng)膜移植供體的潛力。總之，針對(duì)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的不斷深入和完善，將為視網(wǎng)膜變性性疾病中的神經(jīng)細(xì)胞再生難題提供新的基因治療手段;同時(shí)以此為基礎(chǔ)的人類胚胎干細(xì)胞定向分化研究將有可能獲得可用于臨床的新型視網(wǎng)膜組織材料，為視網(wǎng)膜疾病的治療提供新的途徑。

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