藥源性特異質(zhì)肝損傷及其發(fā)生機制的研究進展

蘇怡菁， 江振洲，2， 張 云， 張陸勇，3*

(1.中國藥科大學(xué)江蘇省新藥篩選中心，江蘇南京210009;2.中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇 南京210009;3.中國藥科大學(xué) 江蘇省藥效學(xué)研究與評價服務(wù)中心，江蘇南京210009)

20世紀(jì)90年代初，藥物開發(fā)失敗的主要原因是其難以預(yù)測的藥動學(xué)特征［1］。隨著藥動學(xué)研究的發(fā)展，藥物的動力學(xué)特征日漸易于被預(yù)測，不良反應(yīng)轉(zhuǎn)而成為藥物開發(fā)失敗的主要原因。如溴芬酸(Hunter E B等，Am JGastroenterol，1999年)和曲格列酮(Kohlroser J等，Am JGastroenterol，2000年)因藥源性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)等不良反應(yīng)而遭撤市，利培酮、曲伐沙星、奈法唑酮等也因此被美國FDA列入警告藥物名單［2-3］。

DILI是一類較為嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)，占藥物不良反應(yīng)的10% ～15%［4］，占所有急性肝損傷的50%以上［5］，包括可預(yù)測的DILI和不可預(yù)測的DILI兩大類。對于可預(yù)測的DILI，其機制包括破壞細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、膽汁淤積、活性代謝物毒性、免疫毒性［6］、直接觸發(fā)細胞凋亡以及破壞線粒體功能等［7］;不可預(yù)測的DILI即為藥源性特異質(zhì)肝損傷(idiosyncratic drug induced liver injury，IDILI)，是發(fā)生頻率最高、最值得引起重視的藥物特異質(zhì)反應(yīng)(idiosyncratic drug reaction，IDR)。

IDR僅發(fā)生在少數(shù)用藥者身上(發(fā)生率通常低于5%)，與藥物的藥理效應(yīng)無關(guān)［8］，且與臨床劑量無明顯關(guān)系［9］，而與患者年齡、性別、身體狀態(tài)及是否飲酒等因素相關(guān)［10］，其產(chǎn)生有暫時性和非連續(xù)性的特點(Zimmerman H J，Dis Mon，1993年)，較易發(fā)生于年老者、女性、炎癥患者和飲酒者［11］，是藥物、用藥者自身狀況和環(huán)境綜合作用的結(jié)果。IDR發(fā)生概率較低，藥物的臨床前研究通常無法預(yù)測其發(fā)生［12］，其既可能在患者首次或第2次接觸藥物后發(fā)生，也可能在經(jīng)歷數(shù)周甚至數(shù)月后發(fā)生。該類反應(yīng)涉及人體的各個器官，由于肝臟在藥物代謝過程中處于中心地位，故其成為最易產(chǎn)生IDR的器官［13］。

隨著人們對可預(yù)測的DILI的深入研究，因傳統(tǒng)的藥物肝毒性而遭撤市的藥物已日趨減少，IDILI則受到越來越多的關(guān)注。然而，由于現(xiàn)有的檢測體系尚難以預(yù)測IDILI的發(fā)生，一旦一種很有開發(fā)前景的新藥被發(fā)現(xiàn)可引起IDILI，將導(dǎo)致制藥公司的巨大損失，且此損失不僅表現(xiàn)在經(jīng)濟上，還表現(xiàn)在諸如企業(yè)信譽之類無形資產(chǎn)的損害上，其對受試者帶來的傷害更是難以估量。鑒于此，預(yù)測藥物產(chǎn)生IDILI的風(fēng)險，發(fā)現(xiàn)IDILI的可能的標(biāo)志物，已成為新藥研發(fā)中的熱點［14］。雖然目前對IDILI的發(fā)生機制尚不明確，研究人員僅從代謝、免疫等角度提出了一些假說;但一些可用于此項研究探索的特異質(zhì)肝損傷的動物及細胞模型正在逐步建立。

1 藥源性特異質(zhì)肝損傷的可能機制

從目前的研究來看，IDILI更多的是對一種現(xiàn)象的命名，其機制并不明了。經(jīng)過長期摸索，人們就IDILI的發(fā)生機制提出了若干假說，雖然這些假說之間存在著某些內(nèi)在聯(lián)系，但每一種假說均只涉及IDILI的某一個或幾個方面，至今仍無一種假說能夠?qū)DILI的機制作出全面的解釋，故應(yīng)綜合這些假說來探討某個藥物的IDILI。

根據(jù)目前的假說，大體可將IDILI的發(fā)生機制分為代謝特異質(zhì)和炎癥特異質(zhì)。其中，代謝特異質(zhì)主要與代謝酶的基因多態(tài)性有關(guān)［15］;炎癥特異質(zhì)則解釋了排除代謝差異后IDILI發(fā)生的主要機制［16］，由于炎癥反應(yīng)的廣泛存在性，大多數(shù)研究都采用輕度炎癥模型來模擬IDILI現(xiàn)象。

1.1 炎癥應(yīng)激假說

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)提出，當(dāng)體內(nèi)發(fā)生急性炎癥刺激時，藥物誘導(dǎo)的肝毒性會發(fā)生改變，此時機體更易出現(xiàn)IDILI。中等強度的炎癥刺激可降低機體對藥物產(chǎn)生肝毒性的應(yīng)答閾值，使藥物治療窗變窄，即藥物在一個本應(yīng)安全的劑量下產(chǎn)生毒性反應(yīng);而藥物的存在反過來亦可擴大炎癥應(yīng)激的損傷，使原本輕微的炎癥反應(yīng)造成較嚴(yán)重的后果。由此可見，炎癥與IDILI之間的關(guān)系可從兩方面來看:一方面，IDILI常伴有炎癥反應(yīng)的發(fā)生;另一方面，輕度的炎癥反應(yīng)可增加患者對藥物毒性的敏感性。

人及動物中的炎癥反應(yīng)非常普遍，且許多情況下(如改變膳食習(xí)慣、飲酒、胃腸刺激和外科手術(shù)等)常伴有輕度的炎癥介質(zhì)釋放，因此，某些患者可能因在用藥時伴發(fā)炎癥而出現(xiàn)特異質(zhì)反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，少量脂多糖(LPS)可誘發(fā)輕度炎癥，而LPS與炎癥細胞表面的Toll樣受體4作用后，數(shù)小時內(nèi)即可引起單核細胞和巨噬細胞浸潤、基因表達的改變和多種炎癥介質(zhì)或細胞因子的激活，最終通過旁分泌或體循環(huán)作用于其他組織細胞，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。少量LPS進入肝臟后，可通過激活枯否細胞(Kupffer細胞)等而被直接吞噬，而大量LPS則可導(dǎo)致休克、多器官功能衰竭和死亡［17］。

1.2 活性中間代謝產(chǎn)物假說

Kaplowitz等(Ann Intern Med，1986年)提出，藥物在機體中代謝生成的活性產(chǎn)物會與細胞膜上重要的蛋白共價結(jié)合，破壞膜完整性，造成細胞內(nèi)鈣離子紊亂等問題。與正常個體相比，對藥物敏感的個體可能因體內(nèi)代謝酶的基因多態(tài)性，使得藥物的活性中間代謝產(chǎn)物的種類和生成量發(fā)生變化。糖尿病治療藥物曲格列酮便是通過活性中間代謝物產(chǎn)生毒性的一個典型例子，其在肝內(nèi)被細胞色素 P450酶CYP3A4代謝為5種主要的活性產(chǎn)物，后者通過耗竭谷胱甘肽，并與蛋白及其他親核物質(zhì)結(jié)合［18］，造成肝臟損傷。然而，研究發(fā)現(xiàn)，許多藥物的活性代謝產(chǎn)物并未顯示出比其原形藥物更高的肝毒性，故而可推測活性中間代謝產(chǎn)物只是某些藥物產(chǎn)生IDILI的原因，但未必是所有IDILI發(fā)生的原因［8］。

1.3 基因多態(tài)性假說

基因多態(tài)性假說與活性中間代謝產(chǎn)物假說存在某些相似之處，即都是個體代謝酶的基因多態(tài)性及其導(dǎo)致的對藥物代謝的差異:若某個體的某種藥物代謝酶水平偏低，則會造成此藥在個體體內(nèi)的代謝速率降低，若此藥物原型比代謝物毒性更大，該個體表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)便更強烈［19］?；蚨鄳B(tài)性影響毒性的經(jīng)典藥物是抗結(jié)核藥物異煙肼［20］。曾有研究發(fā)現(xiàn)，不同種族的人群由于基因的多態(tài)性，致使其體內(nèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶的含量不同，乙?；俾什煌悷熾碌拇x速率便不同。據(jù)此出現(xiàn)快代謝和慢代謝人群之說，其中快代謝人群發(fā)生肝毒性的概率大于慢代謝人群［21］。

另外，Gurumurthy等(Am Rev Respir Dis，1984年)還發(fā)現(xiàn)，由于體內(nèi)代謝酶水平的差異，即使不同個體攝入相同劑量的同種藥物，到達毒性閾值的時間也會不同，故毒性出現(xiàn)的時間也不同?；蚨鄳B(tài)性可決定部分藥物的IDILI效應(yīng)，但同樣也不是導(dǎo)致IDILI的唯一原因［22］。

1.4 半抗原假說

半抗原假說由Robin等(J Hepatol，1997年)提出，近年來頗受關(guān)注。該假說認為，某些化學(xué)活性物質(zhì)或活性代謝產(chǎn)物等小分子化合物本身并不能刺激抗體產(chǎn)生，當(dāng)與人體細胞內(nèi)的蛋白共價結(jié)合并形成復(fù)合物后則有可能被自身免疫系統(tǒng)視為外源性抗原，當(dāng)機體繼續(xù)暴露在藥物環(huán)境中時，便會發(fā)生快速的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致由B細胞介導(dǎo)的自身抗體的生成和T細胞的激活，最終造成細胞損傷，這種小分子化合物被稱為半抗原。Parker等(Pharmacol Rev，1982年)指出青霉素導(dǎo)致的特異質(zhì)損傷便與致病性抗體免疫球蛋白E(IgE)相關(guān)，青霉素的β內(nèi)酰胺環(huán)可與體內(nèi)蛋白結(jié)合形成抗原，與IgE抗體作用，導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、白介素(IL)等物質(zhì)，從而造成組織損傷。

但是，目前的研究結(jié)果尚不能明確與藥物及其活性代謝產(chǎn)物結(jié)合的體內(nèi)蛋白種類以及其中可致藥物產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)的蛋白。

1.5 危險因子假說

危險因子假說與半抗原假說有一定關(guān)聯(lián)性。該假說認為，當(dāng)藥物或其代謝產(chǎn)物與蛋白相結(jié)合并同時有一種或多種應(yīng)激信號產(chǎn)生時，免疫損傷才會形成，而相應(yīng)的應(yīng)激信號即為“危險因子”［23］。這些危險因子的種類目前并不清楚，它們有可能是內(nèi)源性的，并因個體的不同而不同。這些信號可以是輕度的炎癥反應(yīng)及其間釋放的細胞因子，細胞因子則可激活獲得性免疫系統(tǒng)，而藥物的繼續(xù)使用便會造成肝臟損傷［24］。

1.6 線粒體失調(diào)假說

研究發(fā)現(xiàn)，某些能夠?qū)е翴DILI的藥物(如曲格列酮、托卡朋、雙氯芬酸、異煙肼等)可使機體出現(xiàn)三磷酸腺苷水平下調(diào)、活性氧增加以及線粒體膜電位下降等線粒體功能失調(diào)現(xiàn)象［25］，且其他外源毒性物質(zhì)、缺氧、炎癥等因素也可改變線粒體功能，從而改變細胞對藥物的敏感性，導(dǎo)致IDILI的產(chǎn)生［26］，因此，線粒體功能失調(diào)可能是IDILI產(chǎn)生的一個重要原因。

1.7 適應(yīng)性缺失假說

對于某一藥物而言，可能其大部分使用者僅產(chǎn)生輕度、可逆的肝毒性，即對藥物產(chǎn)生了適應(yīng)性，而另一小部分人則不能適應(yīng)，最終發(fā)展為明顯的毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為特異質(zhì)損傷，這部分人群即被認為存在適應(yīng)性缺失［27］。例如，Mushin等(Br Med J，1971年)發(fā)現(xiàn)，在使用氟烷作為麻醉劑的病人中，20%會產(chǎn)生輕微、可逆的肝損傷，而僅有0.005%的病人發(fā)展成肝硬化。

目前對于適應(yīng)性缺失這一現(xiàn)象背后的原因所知甚少，推測用藥者對藥物的耐受能力可能與環(huán)境或基因因素相關(guān)。這一假說可與基因多態(tài)性假說相互印證，例如某種抗炎細胞因子或抗凋亡蛋白的多態(tài)性可使某些個體不能夠適應(yīng)微小的機體傷害而導(dǎo)致嚴(yán)重損傷產(chǎn)生［19］。

2 藥源性特異質(zhì)肝損傷的研究方法

目前，對IDILI的研究大多采用基于炎癥應(yīng)激假說而制備的動物輕度炎癥模型，通常的方法是:先通過尾靜脈注射LPS使受試動物處于輕度炎癥狀態(tài)，而后再給予受試藥物，以模擬臨床上IDILI發(fā)生時的狀況。近年來，由于對高通量篩選可致IDILI的藥物的需求的增加及相關(guān)技術(shù)的進步，一些體外模型也逐步被建立［28］。

2.1 體內(nèi)研究方法

動物的體內(nèi)研究對于探索IDILI的發(fā)生機制有著不可替代的作用，理想的動物模型的建立對于實驗研究十分重要［19］。然而，目前用于研究IDILI的大多數(shù)動物模型都存在一定缺陷，且沒有一種動物模型能夠獨立預(yù)測藥物產(chǎn)生IDILI的可能性，或預(yù)測特定病人對某一藥物產(chǎn)生特殊反應(yīng)的可能性［29］。而且，由于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，擬建立與自身免疫相關(guān)的IDILI動物模型更是困難。

Roth等(Toxicol Appl Pharmacol，1997年)發(fā)現(xiàn)，對動物同時給予LPS和安全劑量的肝毒性藥物可導(dǎo)致肝臟損傷，其中被研究較早的肝毒性藥物包括雷尼替丁等。雷尼替丁可導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶升高，但只在極少情況下導(dǎo)致肝臟衰竭。體內(nèi)實驗顯示:將雷尼替丁與少量LPS聯(lián)用時，LPS能激活中性粒細胞，隨后，雷尼替丁引發(fā)免疫反應(yīng)，誘使機體釋放大量炎癥因子并攻擊正常肝細胞，造成肝臟損傷，這一結(jié)果在幾小時內(nèi)即可顯現(xiàn)。

對乙酰氨基酚(APAP)是經(jīng)典的藥源性肝損傷藥物，目前雖尚不十分清楚其致肝損機制，但有證據(jù)顯示，免疫系統(tǒng)參與了APAP致肝損的過程。例如，Blazka等(Toxicol Pathol，1996年)發(fā)現(xiàn)，APAP造成肝臟損傷的嚴(yán)重程度與機體內(nèi)巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細胞因子的水平呈正相關(guān)。Laskin等(Toxicology，2001年)提出，巨噬細胞的作用是APAP致肝損機制的一部分。體內(nèi)研究顯示:在給予APAP前2 h，給大鼠使用巨噬細胞功能抑制劑氯化釓(10 g·L-1)，可有效防止由APAP引起的大鼠肝臟小葉中心壞死，且肝毒性的傳統(tǒng)指標(biāo)血清轉(zhuǎn)氨酶也未出現(xiàn)顯著性升高。然而，對于APAP在輕度炎癥模型中的毒性作用，文獻報道結(jié)果并不一致:Ganey等［30］指出LPS會顯著增加APAP的肝毒性，而Liu等(Toxicology，2000年)則認為LPS的存在可使APAP的肝毒性降低。

氟烷在極少數(shù)情況下可導(dǎo)致較嚴(yán)重的特異質(zhì)肝損。通常給予動物正常劑量的氟烷時并不會引發(fā)肝損，但Moult等(Proc R Soc Med，1975年)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予苯巴比妥后再給予氟烷，會導(dǎo)致中度肝損傷。推測其可能的機制是，苯巴比妥可導(dǎo)致氟烷在代謝過程中釋放大量的自由基，從而間接造成肝損。

2.2 體外研究方法

由于輕度炎癥對肝細胞的損傷涉及多種細胞的相互作用，目前有關(guān)IDILI的體外研究模型尚不多見。Tukov等［31］報道，將大鼠枯否細胞與肝實質(zhì)細胞聯(lián)合培養(yǎng)并用作研究炎癥在藥物肝毒性中作用的體外模型?？莘窦毎c肝實質(zhì)細胞分離于同一只大鼠的肝臟，將2種細胞聯(lián)合培養(yǎng)后分為3組，分別加入LPS、APAP或LPS+APAP，觀察各組細胞變化，并測定炎癥因子的分泌情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS+APAP組細胞中炎癥因子的分泌增加最為明顯，從而造成了最為嚴(yán)重的細胞死亡。提示在體內(nèi)狀態(tài)下，炎癥的存在可能加重藥物的肝毒性作用。此外，Cosgrove等［28］分別應(yīng)用肝原代細胞和HepG2細胞系，加入LPS及TNF、IFNγ、IL-1α、IL-6等細胞因子，造成炎癥模型，并運用這一模型大規(guī)模篩選具有潛在特異質(zhì)肝損傷作用的藥物。將待篩選的90個藥物分別與LPS及細胞因子同時加入細胞培養(yǎng)基中，測定藥物對細胞增殖的抑制率。結(jié)果顯示:19%的藥物與LPS聯(lián)用后對細胞增殖的抑制率提高。提示這些藥物存在潛在的特異質(zhì)肝毒性。

3 總結(jié)與展望

目前對于IDILI的研究僅停留在化學(xué)藥物的范疇，尚不見對中藥進行IDILI評價的報道。雖然中藥反應(yīng)中沒有特異質(zhì)反應(yīng)的稱謂，但其副作用確實存在因人、因時而異的現(xiàn)象。由于中藥的成分復(fù)雜，作用靶點十分廣泛，對于其副作用的把握也就顯得十分困難。

如何界定中藥的特異質(zhì)肝毒性及探究其成因，都是一個全新的課題。中藥的肝腎毒性是阻礙中藥現(xiàn)代化與國際化的一個重要方面，在制藥行業(yè)全面重視特異質(zhì)肝損傷的今天，嘗試對中藥的特異質(zhì)反應(yīng)作一些探索性研究具有重要意義。

目前對藥物特異質(zhì)肝毒性的研究還處于起步階段，已提出的各種理論尚不能全面解釋臨床遇到的各種情況，運用于臨床前研究的動物模型和細胞模型也有待改進和增加。特異質(zhì)肝損傷是與人體、藥物、環(huán)境都有密切關(guān)系的特殊現(xiàn)象，關(guān)于它的研究需綜合考慮多種因素的作用。在藥物評價的初期階段，就應(yīng)考察藥物可能存在的潛在的特異質(zhì)肝損傷作用，這無論對于藥物研發(fā)者還是患者，都有十分重要的意義。

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