三丁基錫和菲對鰻鱺的毒性效應(yīng)

徐文菊，李遠友，夏小安，王樹啟，吳清洋，徐樹德

1.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，汕頭515063

2.韓山師范學(xué)院生物系，潮州521041

三丁基錫和菲對鰻鱺的毒性效應(yīng)

徐文菊1，2，李遠友1，*，夏小安1，王樹啟1，吳清洋1，徐樹德1

1.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，汕頭515063

2.韓山師范學(xué)院生物系，潮州521041

采用腹腔注射方式（每周1次，共5次）將生活于淡水或海水中的日本鰻鱺（Anguilla japonica）暴露于三丁基錫氯化物（TBTCl）和菲（Phe），以研究這兩種污染物對鰻鱺的毒性效應(yīng)以及該效應(yīng)與魚體所處環(huán)境鹽度的關(guān)系.鰻鱺暴露于TBTCl或Phe 1w后，其肝臟和脾臟的組織結(jié)構(gòu)就已發(fā)生明顯病變，且病變程度隨著暴露時間的延長而加劇，其中海水鰻鱺比淡水鰻鱺表現(xiàn)更為嚴重；但肝體指數(shù)（HSI）和性腺組織結(jié)構(gòu)均無明顯變化.暴露于TBTCl 4～5w后，海水鰻鱺肝臟的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性比對照組顯著升高，而淡水鰻鱺組無明顯變化；暴露于TBTCl或Phe 3w后，淡水鰻鱺的血漿皮質(zhì)醇水平顯著升高，但海水鰻鱺組無明顯變化.TBTCl和Phe對淡水或海水鰻鱺的血漿雌二醇（E2）水平均無明顯影響.以上結(jié)果表明：有機錫和菲對鰻鱺的肝臟、脾臟有毒性作用，對皮質(zhì)醇分泌具有內(nèi)分泌干擾作用，且該效應(yīng)與暴露時間和魚體所處環(huán)境鹽度有關(guān).

有機錫；菲；日本鰻鱺；毒性效應(yīng)

1 引言（Introduction）

三丁基錫（Tributyltin,TBT）和菲（Phenanthrene,Phe）是典型的環(huán)境污染物，目前已在自然界中廣泛存在.20世紀60年代以來，三丁基錫化合物被廣泛用于船舶防生物附著油漆的活性添加劑，每年大概有3×106kg的TBT和三苯基錫（Triphenyltin,TPT）被釋放到水環(huán)境中（Hoch,2001）.TBT毒性極強，水環(huán)境中ng·L-1水平即會對海洋軟體動物產(chǎn)生不良影響（Bryan and Gibbs,1991）.Phe是一種典型的低環(huán)類多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs），化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，具有與致癌性相關(guān)的“K區(qū)”（Harvey,1991）.研究菲的毒性效應(yīng)可為了解PAHs的致癌機理提供一定的證據(jù).

水環(huán)境是大部分污染物的最終聚集場所，也是水生動物賴以生存的環(huán)境，而TBT和Phe具有長期殘留性和高蓄積性，因此，它們在水生動物中的含量通常會比水環(huán)境中高得多，其毒性可以通過食物鏈逐級傳遞和放大，甚至危害陸生動物和人類的健康.由于魚類具有與哺乳動物（包括人類）相似的生理系統(tǒng)（馬陶武和王子健，2005），且毒物在細胞和分子水平上的作用機制在所有脊椎動物中高度保守（Gray and Foster,2003），因而在魚類中許多由污染物導(dǎo)致的功能紊亂可能與人類相似.因此，研究典型環(huán)境污染物對魚類的毒性效應(yīng)不僅可以在較早階段發(fā)現(xiàn)污染物的危害并評價環(huán)境質(zhì)量的好壞，而且可以預(yù)測其對陸生動物甚至人類可能產(chǎn)生的類似后果，這對于制定環(huán)境保護的法律法規(guī)、保護水環(huán)境和水生資源、保障人類健康均具有一定的現(xiàn)實意義.

廣鹽性魚類在淡水和海水中的生理狀況并不完全相同，因此它們在不同鹽度下對污染物的反應(yīng)也有所不同.近年來，有關(guān)內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDs）測試和毒理實驗在海水魚或淡水魚中都有研究，但毒性效應(yīng)及其機制與魚體所處環(huán)境鹽度的關(guān)系如何尚鮮有報道.日本鰻鱺（Anguilla japonica）作為一種典型的廣鹽洄游性魚類，主要生活在水體的中下層，與TBT、Phe的主要沉積場所——底泥直接接觸，因此本研究選擇鰻鱺為研究對象，探討不同環(huán)境鹽度下TBT和Phe對魚類的毒性效應(yīng)具有重要的現(xiàn)實意義.

為了減少試驗毒物的使用量和對環(huán)境的影響，本研究采用在體注射實驗方式暴露鰻鱺，從肝體指數(shù)、組織學(xué)病變、肝臟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性、血漿類固醇激素水平變化等方面，研究了氯化三丁基錫（Tributyltin chloride,TBTCl）和Phe對生活在海水和淡水中的鰻鱺的毒性效應(yīng)及其與水環(huán)境鹽度的關(guān)系，以期為不同水環(huán)境鹽度下污染物的毒性效應(yīng)評價及其有效監(jiān)控提供參考依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實驗動物和藥物

實驗用鰻鱺（A.japonica）于2006年3月購于潮州市饒平縣一養(yǎng)鰻場，體重300～500g.實驗前將魚暫養(yǎng)于汕頭大學(xué)南澳臨海實驗站的兩個底部鋪有細沙的水泥養(yǎng)殖池中.將其中一個池的鰻鱺在1周內(nèi)逐步馴化到自然海水中（鹽度32‰左右）養(yǎng)殖，另一池則繼續(xù)養(yǎng)于淡水中.馴養(yǎng)30d后，用于暴露實驗.

受試藥物TBTCl（純度>96%）購自英國Lancaster公司，Phe（純度>98%）購自Aldrich公司.取適量TBTCl和Phe溶于玉米油（Sigma公司）中，分別配成0.5mg·mL-1和5mg·mL-1的注射液盛于棕色玻璃瓶中，保存于4℃冰箱中，使用前恢復(fù)到室溫.

2.2 實驗設(shè)計和取樣

淡水和海水鰻鱺各設(shè)3個組，即TBTCl和Phe處理組及對照組，每組2個平行，每個平行9～10條魚.采用腹腔注射方式對鰻鱺進行藥物暴露，TBTCl和Phe的注射劑量參考國外文獻設(shè)定（Oshiam et al.,1998;Krone and Stein,1999;Nacci et al.,2002;Padrós et al.,2003），分別為每kg體重（BW）0.5mg和5mg，對照組注射相當(dāng)體積（1mL·kg-1（BW））玉米油.每周注射1次，共注射5次.注射后的鰻鱺被裝入有孔塑料框中，養(yǎng)于原來的水泥池中.在實驗開始前和每次注射后第7d取樣并進行下一次注射，隔周在每組的兩個平行間交替進行取樣：包括對該平行所有鰻鱺取血液，殺3條鰻鱺取肝臟、脾臟和性腺；最后一次注射后第7天對所有魚取樣.

每次取樣或注射前，將鰻鱺用0.1%MS-222麻醉，然后稱重、取血，解剖鰻鱺稱肝臟重.血液取出后，轉(zhuǎn)入冰浴的離心管中；在4℃靜置1h后，于4℃、14000rpm離心10min，收集上清液血漿，加入1%硫柳汞1～2μL和Aprotin（6000KU·mL-1，每mL血漿加25μL），然后保存于－80℃冰箱中備測類固醇激素含量.取肝臟放入液氮中速凍后，再保存于－80℃冰箱中，用于測定其中的GST活性.取肝臟、脾臟和性腺組織于Bouin’s液中固定12～24h，然后用70%乙醇溶液保存于4℃冰箱中.組織經(jīng)酒精梯度脫水后，進行石蠟包埋和切片，常規(guī)HE染色后在蔡氏顯微鏡下觀察拍照.

2.3 肝臟GST活性測定

從－80℃冰箱中取出肝臟樣品，稱重后，按質(zhì)量（g）:體積（mL）為1:19的比例加入Tris-HCl勻漿液（pH 7.4，EDTA 0.0001mol·L－1，蔗糖0.01mol·L－1，NaCl 0.8%），冰浴中充分勻漿后，于4℃、1200g離心15min，收集上清液.上清液中蛋白濃度和GST活性的測定，采用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的試劑盒進行.方法詳見文獻（杜永兵等，2007;Du et al.,2008）.

2.4 血漿類固醇激素含量的測定

血漿中皮質(zhì)醇（Cortisol）和雌二醇（estradiol,E2）含量采用北京北方生物技術(shù)研究所的放射免疫試劑盒進行測定.

2.5 數(shù)據(jù)分析處理

肝體指數(shù)（HSI）=100×WL/WB，式中WL、WB分別為肝臟和魚體質(zhì)量（g）.HSI、GST活性以及類固醇激素含量均以平均值±標準誤（Mean±SEM）表示.數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件Kplot 3.0進行Tukey多重比較，檢驗不同處理組與相應(yīng)對照組之間的差異性，當(dāng)p＜0.05時認為差異顯著.

3 結(jié)果（Results）

3.1 鰻鱺受TBTCl和Phe暴露后的中毒癥狀

鰻鱺受TBTCl或Phe暴露后的中毒癥狀相似，主要表現(xiàn)為活力明顯下降，且淡水鰻鱺較海水鰻鱺明顯；暴露5w后，其肝臟出現(xiàn)發(fā)白、腫大現(xiàn)象，少部分魚的膽囊腫大、甚至破裂，膽汁顏色變淡.整個實驗期間無死魚現(xiàn)象.

3.2 TBTCl和Phe對鰻鱺肝體指數(shù)（HSI）的影響

受TBTCl或Phe暴露1～5w后，淡水和海水鰻鱺的HSI均有所升高，但與對照組相比均無顯著差異（p＞0.05）（表1）.

表1 受TBTCl和Phe暴露后鰻鱺的肝體指數(shù)（HSI）Table 1Hepatosomatic index（HSI）of eels exposed to TBTCl and Phe

3.3 TBTCl和Phe對鰻鱺肝臟及脾臟結(jié)構(gòu)的影響

對照組鰻鱺的肝細胞較大，常呈團狀或索狀排列；細胞核一般為圓形或卵圓形，染色較深，位于細胞中央；細胞質(zhì)豐富，嗜酸性（圖1a、b）.受到TBTCl或Phe暴露后，肝細胞出現(xiàn)腫脹、空泡化現(xiàn)象（如圖1中箭頭所指），細胞質(zhì)中嗜酸性物質(zhì)減少，細胞核被擠向邊緣；隨著暴露時間延長，病變有加劇的趨勢；其中，TBTCl對海水鰻鱺肝臟組織的毒害作用（圖1d）較淡水鰻鱺嚴重（圖1c），而Phe的毒害作用正好相反（圖1e、f）.

圖1 對照組和受TBTCl（0.05mg·kg-（1BW））或Phe（5mg·kg-（1BW））暴露5w后的鰻鱺肝臟的顯微結(jié)構(gòu)（a、b：淡水、海水鰻鱺對照組；c、d：淡水、海水鰻鱺TBTCl暴露組；e、f：淡水、海水鰻鱺Phe暴露組）Fig.1The microstructure of liver from control and TBTCl（0.05mg·kg－（1BW））or Phe（5mg·kg－（1BW））exposed（5 weeks）eels（a,b:freshwater and seawater eels in control;c,d:freshwater and seawater eels exposed to TBTCl;e,f:freshwater and seawater eels exposed to Phe）

對照組鰻鱺的脾臟組織沒有明顯的白髓和紅髓之分，其中的淋巴細胞數(shù)量多，有的聚集成團，鐵血黃素沉淀較少（圖2a、b）.當(dāng)?shù)狑~和海水鰻鱺受到TBTCl或Phe暴露后，其脾臟組織的病變癥狀相似，主要表現(xiàn)鐵血黃素沉淀（圖2中三角符號所指）有所增加，有的組織發(fā)生壞死、溶解現(xiàn)象（圖2c、d、e、f）.

圖2 對照組和受TBTC（l0.05mg·kg-（1BW））或Phe（5mg·kg-（1BW））暴露5w后的鰻鱺脾臟的顯微結(jié)構(gòu)（a、b：淡水、海水鰻鱺對照組；c、d：淡水、海水鰻鱺TBTCl暴露組；e、f：淡水、海水鰻鱺Phe暴露組）Fig.2The microstructure of spleen from control and TBTCl（0.05mg·kg-（1BW））or Phe（5mg·kg-（1BW））exposed（5 weeks）eels（a,b:freshwater and seawater eels in control;c,d:freshwater and seawater eels exposed to TBTCl;e,f:freshwater and seawater eels exposed to Phe）

TBTCl和Phe對淡水和海水鰻鱺的性腺組織結(jié)構(gòu)均無明顯影響（圖略）.

3.4 TBTCl和Phe對鰻鱺肝臟GST活性的影響

淡水鰻鱺受TBTCl或Phe暴露1至5w后，其肝臟GST活性與對照組無顯著差異（圖3a）.海水鰻鱺受到TBTCl暴露1～3w或Phe暴露1～5w后，其肝臟GST活性也無明顯變化；但4～5w的TBTCl暴露則顯著提高其GST活性（圖3b）.說明TBTCl和Phe對魚體肝臟GST活性的影響與暴露時間和魚體所處環(huán)境鹽度有關(guān).

圖3 TBTCl和Phe對淡水鰻鱺（a）及海水鰻鱺（b）肝臟GST活性的影響（*:與對照組比較，p＜0.05）Fig.3Effects of TBTCl and Phe on hepatic GST activity in freshwater（a）and seawater（b）eels（*:compared with the control,p＜0.05）

3.5 TBTCl和Phe對鰻鱺血漿皮質(zhì)醇和E2水平的影響

淡水鰻鱺受到Phe暴露1w、3w或受到TBTCl暴露3w后，其血漿皮質(zhì)醇水平顯著高于對照組（圖4a）；暴露5w時，皮質(zhì)醇水平均恢復(fù)到對照水平（圖4a）.海水鰻鱺受到TBTCl或Phe暴露1～5w后，其皮質(zhì)醇水平不受影響（圖4b）.

淡水鰻鱺和海水鰻鱺在受到TBTCl或Phe暴露前的血漿E2水平分別為（3.14±0.22）ng·mL-1和（3.52±0.42）ng·mL-1；當(dāng)受到TBTCl或Phe暴露1至5w后，淡水鰻鱺對照組及藥物暴露組的血漿E2水平在（2.78±0.64）ng·mL-1和（3.74±0.73）ng·mL-1之間，而海水鰻鱺對照組及藥物暴露組的血漿E2水平在（3.42±0.37）ng·mL-1和（4.53±0.44）ng·mL-1之間.統(tǒng)計分析顯示，TBTCl和Phe對海水或淡水鰻鱺的血漿E2水平均無顯著影響（圖表略）.

圖4 TBTCl和Phe對淡水鰻鱺（a）及海水鰻鱺（b）血漿皮質(zhì)醇水平的影響（*:與對照組比較，p＜0.05）Fig.4Effects of TBTCl and Phe on plasma cortisol levels in freshwater（a）and seawater（b）eels（*:compared with the control,p＜0.05）

4 討論（Discussion）

肝臟是動物體內(nèi)的主要解毒器官，也是污染物蓄積和產(chǎn)生毒害作用的主要靶器官之一.當(dāng)魚體受到有毒物質(zhì)暴露后，氧化脅迫作用可使肝臟組織的抗氧化系統(tǒng)做出反應(yīng)，肝臟代謝酶和多功能氧化酶（如GST、過氧化氫酶、肝臟Ⅰ相代謝酶等）活性被誘導(dǎo)或抑制（張景飛和王曉蓉，2003;Shim et al.,2003;馬曉燕等，2007），也可能導(dǎo)致代謝物在肝細胞內(nèi)積累；同時污染物對肝臟的毒害作用可能影響其糖原的代謝或減弱脂肪轉(zhuǎn)化為磷脂的能力，導(dǎo)致脂肪在肝臟內(nèi)積聚.這可能是TBTCl、Phe使肝細胞腫大、HSI升高，細胞質(zhì)中嗜酸性物質(zhì)減少、出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，細胞核邊緣化的原因之一.據(jù)報道，虎利齒脂鯉、大頭麗脂鯉、藍子魚和孔雀魚受到TBT暴露后，其肝臟組織也出現(xiàn)與本試驗相似的結(jié)果（Oliveira Ribeiro et al.,2002;Rabitto et al.,2005;譚燕等，2006;杜永兵等，2007）.

脾臟是魚體的主要造血器官，其中的巨噬細胞可以吞噬衰老的紅細胞，分解血紅蛋白后生成棕黃色的鐵血黃素沉淀.正常魚脾臟中的鐵血黃素沉淀數(shù)量少且面積小，在異常情況下，如受到毒物暴露時，其數(shù)量和面積會增加（Couillard and Hodson,1996;Pacheco and Santos,2002;Schwaiger et al.,2004），這可能是脾臟組織中衰老血紅細胞數(shù)量增加、代謝增強所致（Pacheco and Santos,2002）.相似結(jié)果也在孔雀魚、藍子魚中觀察到（譚燕等，2006;杜永兵等，2007）.

GST是生物體內(nèi)一種重要的II相代謝酶，可催化谷胱甘肽（Glutathione,GSH）與親電子的外源性化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，從而將體內(nèi)有潛在毒性的物質(zhì)降解排出體外.生物體在污染脅迫下，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生成大量活性氧自由基，從而誘導(dǎo)GST活性升高.本試驗中，當(dāng)鰻鱺在海水中暴露于TBTCl 4～5w后，肝臟GST活性顯著升高，可能是魚體的氧化應(yīng)激反應(yīng)所致.這與TBT對文蛤（Meretrix meretrix）和藍子魚的毒性效應(yīng)相同（Huang et al.,2005;杜永兵等，2007）.TBTCl對淡水鰻鱺的GST活性無顯著影響，說明其毒性效應(yīng)與魚體所處環(huán)境鹽度有關(guān)，這可能與魚體在不同鹽度下的生理狀態(tài)不同有關(guān).

當(dāng)魚體受到毒物暴露或環(huán)境脅迫后，其“下丘腦-垂體-腎間組織”軸會做出應(yīng)急反應(yīng)，在促腎上腺皮質(zhì)激素、cAMP調(diào)控下，血漿皮質(zhì)醇水平可較快地升高（Aluru and Vijayan,2004）.故該激素被稱為基本的“應(yīng)激激素”、且具有作為早期監(jiān)測和評估環(huán)境污染物的輔助標志物的潛在功能.本實驗中，淡水鰻鱺暴露于Phe 1w和3w或暴露于TBTCl 3w后，其血漿皮質(zhì)醇水平顯著升高，說明該應(yīng)急反應(yīng)系統(tǒng)正常；相反，暴露5周后則恢復(fù)到對照組水平，這可能與魚體的自身適應(yīng)性有關(guān).與此相似，鰻鱺暴露于柴油污染水體3h后，其血漿皮質(zhì)醇水平顯著提高，而4h時恢復(fù)到對照水平（Pacheco and Santos,2002）.與淡水鰻鱺不同，海水鰻鱺的血漿皮質(zhì)醇水平不受影響，說明TBTCl和Phe的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)與魚體所處環(huán)境鹽度有關(guān).這種鹽度差異可能與皮質(zhì)醇在淡水鰻鱺和海水鰻鱺滲透壓調(diào)節(jié)中的作用有關(guān)，其具體機制有待進一步探討.

本研究中，TBTCl和Phe對鰻鱺的精巢或卵巢組織結(jié)構(gòu)無明顯影響.與此結(jié)果相一致，TBTCl和Phe對其血漿E2水平也無明顯影響.同樣，Rocha Monteiro等（2000）以含Phe的食物投喂比目魚（Platichthys flesus）12w后，其卵巢組織結(jié)構(gòu)也沒有明顯病理變化.

總之，本研究結(jié)果說明，在較低的暴露濃度下（TBTCl,0.5mg·kg-1（BW）；Phe,5mg·kg-1（BW）），有機錫和菲對鰻鱺的肝臟、脾臟組織有明顯毒性作用，對皮質(zhì)醇分泌具有內(nèi)分泌干擾作用，且該效應(yīng)與暴露時間和魚體所處環(huán)境鹽度有關(guān).說明鰻鱺的血漿皮質(zhì)醇水平、肝臟GST活性，肝臟和脾臟組織的病變等可以用于評估不同鹽度環(huán)境中有機錫和菲等環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)參考指標，鰻鱺具有開發(fā)為環(huán)境污染監(jiān)測生物的潛力.

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Toxic Effects of Tributyltin and Phenanthrene on Eels

XU Wen-ju1，2，LI Yuan-you1，*，XIA Xiao-an1，WANG Shu-qi1，WU Qing-yang1，XU Shu-de1

1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biology in Shantou University,Shantou 515063
2.Biology Department of Hanshan Normal University,Chaozhou 521041

In order to investigate the toxic effects of tributyltin chloride（TBTCl）and phenanthrene（Phe）on Japanese eel Anguilla japonica and their relationship with ambient salinities,TBTCl and Phe were administered via the intraperitoneal injection（once a week and five times in total）to the eels which were cultured in freshwater or seawater.After the eels were exposed to TBTCl or Phe for one week,obvious histopathological changes were observed in liver and spleen,and the symptoms in seawater eels were more serious than those in freshwater eels and were aggravated with exposure duration in five weeks;however,changes were not obvious either in hepatosomatic indexes（HSI）or in gonadal microstructure.Compared with that in the respective control groups,obvious increase of hepatic glutathione-S-transferase（GST）activity was observed in seawater eels but not in freshwater eels after 4～5 weeks’exposure to TBTCl,and that of plasma cortisol levels were detected in freshwater eels but not in seawater eels after 3 weeks’exposure to TBTCl or Phe.TBTCl or Phe had no obvious effect on plasma estradiol levels in either freshwater or seawater eels.The results demonstrate that both TBTCl and Phe have toxic effects on liver and spleen,and display endocrine disruption effects on cortisol secretion in eels,but the effects are related to exposure duration and water salinity.

organotin；phenanthrene；Anguilla japonica；toxic effects

4 May 2009accepted3 August 2009

1673-5897（2010）2-229-07

X171.5

A

2009-05-04錄用日期：2009-08-03

國家自然科學(xué)基金項目（No.30570325）

徐文菊（1983—），女，碩士，教師；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:yyli@stu.edu.cn

李遠友（1964—），男，教授，留學(xué)回國博士后，博士生導(dǎo)師.汕頭大學(xué)海洋生物研究所所長兼廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室主任，主要從事魚類生理與分子生物學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)等方面的研究工作.