氟苯尼考?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫檢測(cè)方法的研究

馮才茂， 賈 瑜， 馬孝斌， 張德紅

(北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206)

氟苯尼考?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫檢測(cè)方法的研究

馮才茂， 賈 瑜， 馬孝斌， 張德紅

(北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206)

對(duì)氟苯尼考進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造制備半抗原及抗原，免疫家兔得到多克隆抗體。經(jīng)測(cè)定，該抗體對(duì)氟苯尼考和氟苯尼考胺均有反應(yīng)，且靈敏度較高，效價(jià)達(dá)到1∶480 000;在此基礎(chǔ)上通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)的優(yōu)化建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)限為0.5 μg/kg，以20，50 μg/kg進(jìn)行空白樣品添加實(shí)驗(yàn)，回收率為82.5% ～96.0%，批間變異系數(shù)在4.1% ～15.2%，可初步用于動(dòng)物組織樣本中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)．

氟苯尼考;抗原制備;酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

氟苯尼考(florfenicol)，又名氟甲砜霉素，相對(duì)分子質(zhì)量為358.213，是一種無臭的白色結(jié)晶，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，易溶于二甲基甲酰胺和甲醇，具有吸收好、體內(nèi)分布廣、廣譜抗菌、安全高效等特點(diǎn)，對(duì)敏感菌所致的畜禽細(xì)菌性疾病治療效果顯著，作為氯霉素的替代藥物，廣泛應(yīng)用于治療畜禽及水產(chǎn)的細(xì)菌性疾?。?］．氟苯尼考經(jīng)動(dòng)物體代謝后殘留物主要為氟苯尼考、氟苯尼考胺、氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸等，在不同動(dòng)物及不同臟器中代謝物的比例和成分有所不同，根據(jù)目前檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，主要以氟苯尼考和氟苯尼考胺作為其殘留標(biāo)識(shí)物［2］．

按推薦劑量使用時(shí)，氟苯尼考克服了氯霉素及甲砜霉素所致的再生障礙貧血的危險(xiǎn)及其他毒性，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成危害［3］．由于在實(shí)際生產(chǎn)中，往往存在用藥情況復(fù)雜，超劑量添加飼喂等，從而導(dǎo)致藥物殘留，甚至危害人體健康．各國(guó)對(duì)氟苯尼考的最大殘留量均有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，如日本食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度中規(guī)定，在豬和牛的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟等殘留限量為0.2 mg/kg;歐盟規(guī)定氟苯尼考在牛肌肉、肝、腎中殘留限量分別為 200，3 000，300 μg/kg，在雞的肌肉、脂肪、肝、腎中殘留限量分別為 100，200，2 000，300 μg/kg，在鰭魚類肌肉及皮殘留限量為1 000 μg/kg，在豬的肌肉、皮和脂肪、肝、腎中殘留限量分別為 100，500，2 000，500 μg/kg［4］;我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告也對(duì)其殘留限量做出了嚴(yán)格規(guī)定．

圖1 氟苯尼考分子結(jié)構(gòu)式Fig．1 Molecular structure of florfenicol

目前氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的檢測(cè)主要以高效液相色譜等理化分析方法為主［5－6］，其檢測(cè)靈敏度分別為0.03～0.1×10－6，但其樣本處理復(fù)雜，儀器操作難度較高，因此不適于大量樣品的快速檢測(cè)．酶聯(lián)免疫檢測(cè)是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)方法，簡(jiǎn)便易于操作，且具有靈敏度高，特異性好等特點(diǎn)，已經(jīng)在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也公布了一系列以酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法為檢測(cè)手段的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，酶聯(lián)免疫技術(shù)已經(jīng)超出了一般的快速篩選方法的范疇．本研究即著手建立一種氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法．

1 材料和方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

氟苯尼考、氟苯尼考胺、甲砜霉素和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司;牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA，美國(guó)Sigma公司;羊抗兔HRP標(biāo)記二抗，上海西寶生物;酶標(biāo)板，Costar公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑由本單位自行配制;其他常規(guī)試劑購自于北京化學(xué)試劑公司．

實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔來自于國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房．

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

MK3型酶標(biāo)儀，芬蘭雷伯公司;TD5型離心機(jī)，上海安亭公司;DSY-III型氮吹儀，北京東方精華苑公司;QL-901型渦旋混合儀，江蘇希望公司;其余為常規(guī)儀器．

1.3 檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià)

1.3.1 氟苯尼考抗原的制備

將氟苯尼考胺和BSA通過碳化二亞胺法偶聯(lián)得到免疫原(FF-BSA)，制備過程為:將氟苯尼考胺10 mg溶解于1 mL水中(溶液I)，取BSA 50 mg用5 mL水溶解后加入溶液I中，再加入EDC 25 mg攪拌反應(yīng)過夜，即得到免疫原FF-BSA．包被原是將氟苯尼考胺半抗原和卵清蛋白采用EDC法進(jìn)行偶聯(lián)得到的，其制備過程為:取氟苯尼考胺5 mg用0.5 mL水溶解(溶液I)，取25 mg的EDC加入溶液I中，活化反應(yīng)30 min，取卵清蛋白20 mg用2.7 mL水溶解后加入，攪拌反應(yīng)過夜，即得到包被原(FF-OVA)．

1.3.2 氟苯尼考胺多克隆抗體的制備及評(píng)價(jià)

采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以FF-BSA作為免疫原，免疫劑量為1.0 mg/kg體重．首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑．10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，經(jīng)飽和硫酸銨純化得到多克隆抗體．用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)制得的抗體的效價(jià)及其與氟苯尼考、氟苯尼考胺、甲砜霉素、氯霉素的交叉反應(yīng)率，對(duì)其特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)．

1.3.3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用1.3.2實(shí)驗(yàn)制備的抗原抗體，已測(cè)定的抗體效價(jià)結(jié)果為基礎(chǔ)，通過優(yōu)化加樣方式和時(shí)間，對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的曲線進(jìn)行回歸分析標(biāo)價(jià)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.3.3.2 酶標(biāo)板的制備

優(yōu)化不同的包被緩沖液和包被時(shí)間，建立最佳的包被條件．

1.3.3.3 動(dòng)物組織樣本的處理方法

優(yōu)化不同的有機(jī)試劑及其提取時(shí)間，建立回收率最好的樣本前處理方法．

1.4 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.4.1 樣本最低檢測(cè)限的測(cè)定

對(duì)空白樣本分別進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本的最低檢測(cè)限．

1.4.2 陰性樣品添加回收率的測(cè)定

取2個(gè)濃度的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液20，50 μg/kg，分別對(duì)樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度．

1.4.3 精密度測(cè)定

分別從3個(gè)不同的時(shí)間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個(gè)試劑盒，每板各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定4.5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)．

2 結(jié)果與討論

2.1 抗原的制備

獸藥抗生素類多數(shù)為小分子，沒有免疫原性，不能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，需要與大分子如BSA、OVA等進(jìn)行偶聯(lián)，增強(qiáng)其免疫原性，才能產(chǎn)生效價(jià)較高的抗體．本研究利用氟苯尼考胺中的胺基通過碳化二亞胺法與BSA、OVA進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原和包被原．對(duì)制備得到的偶聯(lián)抗原進(jìn)行紫外掃描，按照如下公式計(jì)算偶聯(lián)比，具體操作過程為:準(zhǔn)確稱取A、B兩種物質(zhì)，用PBS緩沖液配成確切濃度的溶液，另取少量的偶聯(lián)物，用相同的PBS稀釋．分別用紫外掃描測(cè)定這3種溶液在A和B 2種物質(zhì)最大吸收峰波長(zhǎng)處的吸光度值(即 AAam、AAbm、ABam、ABbm、ACam、ACbm)，同時(shí)根據(jù)A和B物質(zhì)的濃度分別計(jì)算KAam、KAbm、KBam、KBbm)，例如

經(jīng)計(jì)算得到FF與BSA和OVA的偶聯(lián)比(Ca/Cb)分別為12∶1和 14∶1，故證明偶聯(lián)成功．

2.2 多克隆抗體的制備及評(píng)價(jià)

2.2.1 抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

通過效價(jià)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)制備的兔抗氟苯尼考多克隆抗體的效價(jià)在1∶40 000．

2.2.2 抗體交叉反應(yīng)測(cè)定

選擇與氟苯尼考胺有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的3種藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率，結(jié)果如表1．

表1 氟苯尼考多克隆抗體交叉反應(yīng)測(cè)定Tab．1 Cross-reactivity determination of florfenicol polyclonal antibody

2.3 ELISA檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)

通過常規(guī)反應(yīng)模式建立ELISA方法，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)定［7］．

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5 μg/kg 的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品建立雙對(duì)數(shù)模型標(biāo)準(zhǔn)，如圖2．

所建立的曲線線性方程為y=0.517 339－2.203 74x，其中x為氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值

式中A為不同濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值，A0為0標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值，方程相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.99．

圖2 氟苯尼考胺多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2 Standard curve of florfenicol based on polyclonal antibody

2.3.2 建立ELISA檢測(cè)方法

2.3.2.1 酶標(biāo)板的制備

通過實(shí)驗(yàn)，最終確定的包被條件為:用包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)將FF-OVA稀釋成0.06 ～0.1 μg/mL，每孔加入 100 μL，37 ℃孵育 2 h后，傾去包被液，用PBS-T洗板2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150 μL封閉液(含有0.5%OVA的PBS)，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

2.3.2.2 樣本前處理方法的確定

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化確定最終的樣本前處理方法為:稱取3 g均質(zhì)后的組織樣本到50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10 min，3 000 g以上，室溫(20 ～25 ℃)離心10 min;移取4 mL上層有機(jī)相至10 mL干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)獯蹈桑尤? mL正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)1 min，再加1 mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)10 s，3 000 g以上，室溫離心10 min;除去上層有機(jī)相，取下層50 μL用于分析．

向制備好的酶標(biāo)板微孔中加入氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液50 μL，再加入氟苯尼考胺抗體工作液50 μL，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，倒出孔中液體，每孔加入250 μL洗滌液，30 s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干．加入酶標(biāo)二抗100 μL，37℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15 min后，加入2 mol/L終止液硫酸50 μL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值．

2.3.3 評(píng)價(jià)ELISA方法

2.3.3.1 樣本最低檢測(cè)限的測(cè)定

通過對(duì)20份空白樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表2，表明所建方法最低檢測(cè)限為0.5 μg/kg．

表2 空白樣品測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab．2 Results of blank sample measurement μg/kg

2.3.3.2 陰性樣品添加回收率的測(cè)定

氟苯尼考在畜牧、水產(chǎn)等領(lǐng)域中均有應(yīng)用．本研究?jī)H以豬肉樣本為例進(jìn)行說明，考慮到魚、蝦等水產(chǎn)品脂肪含量較高，實(shí)際操作時(shí)還需去脂，對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化才能進(jìn)行檢測(cè)．以豬肉樣本為例進(jìn)行添加，結(jié)果見表3．

結(jié)果表明各樣本以20，50 μg/kg氟苯尼考胺添加回收率均在82.5%～96.0%．

2.3.3.3 精密度測(cè)定

精密度測(cè)定結(jié)果見表4．

表3 試劑盒的準(zhǔn)確度Tab．3 Percent of accuracy of kit

表4 ELISA方法精密度測(cè)定結(jié)果Tab．4 Precision measure results of ELISA method%

由表4可知，3批酶標(biāo)板對(duì)4.5 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)在4.1% ～15.2%，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定．

3 結(jié)論

本研究通過合成氟苯尼考半抗原及抗原，制備了兔多克隆抗體．通過對(duì)抗體進(jìn)行評(píng)測(cè)和方法優(yōu)化建立了一種氟苯尼考的ELISA快速檢測(cè)檢測(cè)方法．該方法最低檢測(cè)限為 0.5 μg/kg，以 20，50 μg/kg 進(jìn)行空白樣品添加實(shí)驗(yàn)時(shí)回收率為82.5%～96.0%，批間變異系數(shù)在4.1% ～15.2%，可以初步用于動(dòng)物組織中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)．

［1］孫豐云，張素霞，沈建忠，等．蝦肉中氯霉素甲砜霉素氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留氣相色譜—微電子捕獲檢測(cè)法［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，42(10):66-67．

［2］孫澤祥，楊挺，鮑偉華，等．雞組織中氟苯尼考和氟苯尼考胺代謝動(dòng)力研究［J］．試驗(yàn)研究，2009，21(8):21-23．

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［4］Ueno R，Terakado H，Aoki T．Determination of florfenicol in cultured yellowtail by high performance liquid chromatography［J］．Bull Fac Bioresour Mie Univ，2000，24:23-29．

［5］Tamoko N，Hisao O．Detection of residual chloramphenicol，florfenicol，and thiamphenicol in yellow tail fish muscle by capillary gas chromatographt-mass spectrometry［J］．J Agric Food Chem，1996，44:1280-1284．

［6］魏海濤，方秋華，曾振玲，等．高效液相色譜法測(cè)定豬血漿中氟苯尼考的含量［J］．廣東畜牧獸醫(yī)科技，2010，35(3):31-33．

［7］萬宇平，吳鵬，馮月君，等．食品中磺胺類藥物化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的初步研究［J］．北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，30(2):27-34．

(責(zé)任編輯:李 寧)

Detection of Florfenicol Residues by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FENG Cai-mao， JIA Yu， MA Xiao-bin， ZHANG De-hong
(Beijing Kwinbon Biotechnology Co．Ltd．，Beijing 102206，China)

The structure of florfenicol was transformed to prepare the hapten antigen and antigen，the polyclonal antibody was obtained by immunized rabbit．The determination of the antibody showed high sensitivity and have reactions on florfenicol and florfenicol amine，the titer was 1∶480000．On this basis，the indirect competitive ELISA method was established through the optimization of the parameters．The detection limit of the established ELISA method was 0.5 μg/kg，the sample recovery was 82.5%to 96.0%by 20，50 μg/kg addition to the blank experiment，and the inter-assay coefficient ranged from 4.1%to 15.2%．The method could be used for preliminary detection of florfenicol residues in animal tissue samples．

florfenicol;antigen preparation;enzyme-linked immunosorbent assay

TS201.6;S859.84

A

1671-1513(2012)04-0050-04

2011-12-20

馮才茂，男，工程師，主要從事食品安全檢測(cè)方面的工作;

賈 瑜，女，碩士，主要從事食品安全檢測(cè)方面的工作．通訊作者．