木犀草素聯(lián)合蘆丁抗6-羥多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病大鼠震顫及神經(jīng)保護(hù)作用

何國(guó)榮，成銀霞，穆 鑫，李曉秀，于 昕，王月華，方蓮花，杜冠華

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，“藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050;2.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東煙臺(tái) 264005)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中腦黑質(zhì)進(jìn)行性退變而引起的神經(jīng)退行性疾病，PD的發(fā)生與年齡老化、環(huán)境毒素以及遺傳易感性等因素有關(guān)。藥物治療是目前治療PD的主要方法，較為有效的是以左旋多巴為代表的多巴胺(dopamine，DA)替代療法，然而，長(zhǎng)期應(yīng)用左旋多巴會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)波動(dòng)和運(yùn)動(dòng)障礙等副作用，使用后期還會(huì)加速PD自然病程。針對(duì)其他靶點(diǎn)的藥物也存在療效不理想、副作用大等缺陷［1］。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為抗PD藥物研究的熱點(diǎn)。

木犀草素(luteolin)廣泛分布在金銀花、菊花、青蘭、紫蘇、白毛夏枯草等植物中，具有抗氧化、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用，臨床用于治療腫瘤，肝炎，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等。近期研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用［2－4］。蘆丁(rutin)又名蕓香苷，是主要存在于蕓香全草、豆科植物槐的花蕾、果實(shí)、金絲桃科植物紅旱蓮全草及蓼科植物蕎麥籽苗中的一種黃酮類(lèi)化合物。研究表明蘆丁具有止血、降壓、抗炎、抗病毒、舒張血管、抑制腦梗死等多方面的生物學(xué)活性，其復(fù)方制劑對(duì)心腦血管疾病有明顯的治療作用，特別是血管性癡呆［5－6］。這些研究結(jié)果提示，木犀草素和蘆丁均對(duì)神經(jīng)退行性疾病可能有較好的療效。

本實(shí)驗(yàn)室前期建立了6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損傷 SH-SY5Y細(xì)胞模型和促PC12細(xì)胞分化模型，對(duì)天然產(chǎn)物庫(kù)內(nèi)樣品進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)木犀草素和蘆丁組合物(mixture of luteolin and rutin，MLR)能劑量依賴(lài)性地減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和促PC12細(xì)胞分化。本研究采用腦室內(nèi)注射6-OHDA制備PD大鼠模型，進(jìn)一步考察MLR對(duì)模型大鼠的行為及中腦神經(jīng)元損傷的改善作用，并從抑制炎癥、保護(hù)神經(jīng)元及恢復(fù)神經(jīng)元功能等方面探討MLR可能的作用機(jī)制，為其應(yīng)用于PD臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Sprague Dawley(SD)大鼠，2～3月齡，♂，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào):SCXK(京)2007-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為:溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度:55%-65%，通風(fēng)干燥，12 h光照周期。

1.1.2 儀器 MP8001腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，DXP-2大小鼠轉(zhuǎn)棒儀和DZIL-2大鼠自主活動(dòng)程序自動(dòng)控制儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，5810R型高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)，SM900冰凍切片機(jī)(美國(guó)Leica公司)，X71正置熒光顯微鏡(日本OLYPUS公司)。

1.1.3 試劑與藥品 MLR(美國(guó) SYNORx，Inc.生產(chǎn)，批號(hào):062107，含木犀草素和蘆丁各50%)。美多芭片(上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):SH 0502)。6-OHDA、DA、阿 樸 嗎 啡 (apomorphine，APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(trysine hydroxylase，TH)抗體，購(gòu)自Sigma-aldrich公司;多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transport protein，DAT)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)、購(gòu)自Santa Cruz公司，羊抗小鼠IgG、卵白素-生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC)試劑盒、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色劑，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 健康♂ SD大鼠，3%的戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉，頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，在左側(cè)相當(dāng)于前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrain bundle，MFB)區(qū)的顱骨表面鉆孔，直徑約2.5 mm。清理腦膜后，行MFB兩點(diǎn)注射6-OHDA(4 g·L－1)，(1)TB:－2.3 mm，AP:－4.4 mm，ML:1.2 mm，V:－7.8 mm;(2)TB:+3.4 mm，AP:－4.0 mm，ML:0.8 mm，V:－8.0 mm。在三維推動(dòng)器的引導(dǎo)下兩點(diǎn)各注射 6-OHDA 3 μl，注射速度 1 μl·min－1，注射完畢后留針10 min，緩慢退針。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素20萬(wàn)U·d－1以防感染。大鼠清醒后置于籠內(nèi)正常環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2 模型評(píng)價(jià) 術(shù)后1周大鼠給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)，于直徑40 cm的有機(jī)玻璃桶中觀察其運(yùn)動(dòng)變化，每周1次，連續(xù)測(cè)試2周，若大鼠恒定向右旋轉(zhuǎn)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞280 r/40 min，則視為造模成功，經(jīng)過(guò)上述方法篩選，獲得58只合格模型動(dòng)物。

1.2.3 分組與給藥 將造模成功的58只PD大鼠隨機(jī)分為模型組、美多芭組(50 mg·kg－1，ig)、MLR低(125 mg·kg－1，ig)、中(250 mg·kg－1，ig)、高劑量(375 mg·kg－1，ig)組，另取手術(shù)并注射生理鹽水，經(jīng)檢測(cè)無(wú)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的大鼠10只為假手術(shù)組，模型組10只，其他每組各12只，共6組。分組后即給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃給予蒸餾水2 ml，每日1次，連續(xù)3周。

1.2.4 行為學(xué)檢測(cè) 模型動(dòng)物分組后每隔7 d進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)。于給藥后30 min給予APO(0.5 mg·kg－1，sc)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，記錄40 min 內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)(方法同“1.2.2”)。

1.2.5 大鼠肌電測(cè)定 清醒大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用BL-420E+生物信號(hào)采集器記錄肌電。將肌電記錄電極固定在大鼠右側(cè)臀部肌肉，電極間隔約1 cm，參考電極接地，記錄震顫引起的肌電活動(dòng)(electromyography，EMG)，震顫的程度采用EMG頻率和幅度表示。分別記錄1 min內(nèi)大鼠震顫的頻率和幅度，共3次，取平均值。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 每組取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg－1，ip)麻醉后開(kāi)胸，動(dòng)脈插管，以生理鹽水沖洗血液后灌注含0.04多聚甲醛的0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.2 ～7.4)固定組織，斷頭取全腦固定4 h，以含0.3的蔗糖的多聚甲醛固定液內(nèi)脫水，待組織下沉后修整組織塊，取中腦腹側(cè)作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為20 μm。切片首先與一抗(TH，1 ∶500;DAT，1 ∶200;GFAP，1∶400)4℃孵育過(guò)夜;然后分別與生物素標(biāo)記的二抗(1∶300)反應(yīng)1 h以及卵白素－生物素復(fù)合物反應(yīng)2 h，最后用含有DAB的緩沖液顯色。

神經(jīng)元計(jì)數(shù)方法:隨機(jī)選取每只大鼠腦切片5張，分別在右側(cè)黑質(zhì)(substantia nigra，SN)陽(yáng)性細(xì)胞密集區(qū)中央部分取4個(gè)互不重疊的高倍視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)TH、DAT、GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.7 外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 另取正常大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，0.1的水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻醉，俯臥固定。分離坐骨神經(jīng)干，刺激電極置于游離的坐骨神經(jīng)干近心端;引導(dǎo)電極置于坐骨神經(jīng)干遠(yuǎn)心端，兩電極相距約1 cm。采用BL-420E+型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，刺激信號(hào)0.6 mv，0.02 ms，單刺激，信號(hào)記錄采集間隔為0.01 s，1 kHz濾波，引導(dǎo)信號(hào)放大50倍，計(jì)算神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位潛伏期，神經(jīng)傳導(dǎo)速度計(jì)算公式為:

V=刺激電極到引導(dǎo)電極的距離(mm)/潛伏期(ms)。

將0.1 g·L－1的普魯卡因溶液(Procaine)和0.1 g·L－1的MLR溶液直接滴在坐骨神經(jīng)上，觀察藥物對(duì)坐骨神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)速度的影響，以生理鹽水組(normal saline，NS)作為對(duì)照組。每5 min給予一次電刺激并記錄電信號(hào)傳導(dǎo)速度，記錄30 min。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠無(wú)異常行為，模型組大鼠可見(jiàn)活動(dòng)明顯減少、反應(yīng)遲鈍、肢體震顫、嗅探、偏斜、弓背、尾僵直、豎毛等異常行為。給予美多芭2 h內(nèi)大鼠僵住行為明顯，隨后緩解，給藥一段時(shí)間后大鼠的異常行為有所改善;MLR各給藥組大鼠在給藥后沒(méi)有僵住行為產(chǎn)生，持續(xù)給藥可改善模型大鼠出現(xiàn)的上述異常行為。

以APO誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)，其中，假手術(shù)組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)變化;模型組大鼠測(cè)定旋轉(zhuǎn)圈數(shù)維持360 r/40 min左右，美多芭(madopar)組于給藥后第1周旋轉(zhuǎn)圈數(shù)有所增加，其后2周恢復(fù)到給藥前水平，大鼠運(yùn)動(dòng)變化給藥前后差異無(wú)顯著性;MLR低、中、高劑量組給藥后大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)也無(wú)差異。各組大鼠給藥前后旋轉(zhuǎn)情況見(jiàn)Fig 1所示。

Fig 1 Rotational behavior in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.2 肌電活動(dòng) 假手術(shù)組大鼠靜息狀態(tài)EMG無(wú)明顯可檢測(cè)信號(hào)，模型組大鼠可見(jiàn)連續(xù)的陣發(fā)性簇狀電信號(hào)(P＜0.01)，其節(jié)律與大鼠震顫活動(dòng)的節(jié)律相一致，表現(xiàn)出PD模型大鼠的特殊癥狀特征。各給藥組給藥前EMG值與模型組無(wú)差異，給藥后40 min，與模型相比，陣發(fā)性簇狀電信號(hào)出現(xiàn)的頻率和幅度均明顯降低，且具有劑量依賴(lài)性;其中，MLR中、高劑量組改善模型動(dòng)物震顫的作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥美多芭組(Fig 2)。

Fig 2Tremor in 6-OHDA unilaterally lesioned rats(±s，n=10)

2.3 免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)TH表達(dá) 假手術(shù)組大鼠SN的TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)清晰，TH表達(dá)高，免疫活性強(qiáng)，細(xì)胞胞體和纖維染色較深，有明顯可見(jiàn)的免疫陽(yáng)性突起;6-OHDA偏側(cè)損傷大鼠毀損側(cè)SN TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目較假手術(shù)組下降95%(P＜0.01)，免疫活性差，胞質(zhì)著色淡，細(xì)胞輪廓不清晰。MLR各給藥組神經(jīng)元數(shù)目較模型組有所增加，中、高劑量組的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥美多芭相似(P＜0.01)，TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目較模型組增加，MLR高劑量組TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目約為模型組的499.14%(Fig 3)。

A:Representative photographs showing.sham(a)，6-OHDA(b)，6-OHDA+madopar(c)，6-OHDA+MLR(125mg·kg－1)(d)，6-OHDA+MLR(250 mg·kg－1)(e)，6-OHDA+MLR(375 mg·kg－1)(f);B:Summary of the effect of MLR on 6-OHDA induced TH immunoreactive neurons in the SN.＊＊P＜0.01 vs sham group，##P＜0.01 vs 6-OHDA group

2.3.2 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)DAT表達(dá) DAT主要位于神經(jīng)元軸突和末梢的質(zhì)膜上。假手術(shù)組DAT表達(dá)高，免疫活性強(qiáng)，胞質(zhì)濃染，細(xì)胞輪廓較清晰。模型組DAT表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，免疫活性差，胞質(zhì)著色淺，細(xì)胞形態(tài)模糊。各給藥組均可改善6-OHDA所致DAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的減少，MLR作用好于陽(yáng)性對(duì)照藥美多芭，但差異未見(jiàn)顯著性(P＞0.05)(Fig 4)。

Fig 4 DAT positive neurons immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.3.3 大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)GFAP表達(dá) 假手術(shù)組GFAP表達(dá)較低，胞質(zhì)著色淡，模型組GFAP表達(dá)顯著增加(P＜0.01，比假手術(shù)組增加了188.59%)，胞質(zhì)著色加深，各給藥組均可降低GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目(P＜0.01)，MLR高劑量組GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目比模型組降低了43.68%(Fig 5)。

Fig 5 GFAP positive astrocyte immunoreactivity in the SN of rats(±s，n=5)(×400)

2.4 外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度 在給予生理鹽水時(shí)，大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度保持在0.4～0.8 m·s－1之間;而給予普魯卡因溶液5 min，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度迅速增加，然后傳導(dǎo)速度明顯下降。給予MLR后，神經(jīng)傳導(dǎo)速度沒(méi)有變化，提示MLR可能對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)速度沒(méi)有影響(Fig 6)。

Fig 6 The peripheral nerve conduction velocity in normal rats(±s，n=6)

3 討論

靜止性震顫是PD主要臨床特征之一。目前認(rèn)為，PD患者靜止性震顫主要與基底神經(jīng)節(jié)－丘腦－皮層傳遞環(huán)路有關(guān)。黑質(zhì)－紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維變性使這一環(huán)路中具有節(jié)律性放電活動(dòng)的神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)并同步化，最后通過(guò)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的節(jié)律性興奮而產(chǎn)生震顫。目前，臨床針對(duì)靜止性震顫主要采用DA替代療法、抗膽堿藥物、選擇性乙酰膽堿受體拮抗劑等進(jìn)行治療，由于不良反應(yīng)明顯、難以控制疾病病理進(jìn)程等原因，亟需研發(fā)療效明顯、毒副作用小的抗 PD 藥物［1，7－8］。

本研究結(jié)果顯示，MLR各給藥組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)在給藥前后沒(méi)有變化，與模型組相比差異也無(wú)顯著性，表明MLR對(duì)APO誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)沒(méi)有影響，提示MLR抑制震顫的作用不是通過(guò)多巴胺受體產(chǎn)生的。行為學(xué)觀察證實(shí)，MLR對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙有改善趨勢(shì)。但是，目前還缺少可靠的量化指標(biāo)對(duì)運(yùn)動(dòng)障礙進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究首次將EMG檢測(cè)用于評(píng)價(jià)PD模型大鼠的震顫程度。結(jié)果表明，美多芭和MLR各劑量對(duì)大鼠震顫頻率和幅度有明顯的抑制作用，且MLR各給藥組具有良好的量效關(guān)系。該檢測(cè)方法的建立為抗PD藥物藥效學(xué)研究與作用機(jī)制考察提供了更有效的評(píng)價(jià)技術(shù)。

靜止性震顫即可以是中樞性震顫也可以是外周性震顫。在減輕震顫方面，MLR是否直接抑制外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度，目前仍不清楚。因此，考察了MLR對(duì)正常大鼠外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MLR抑制大鼠震顫與外周神經(jīng)沒(méi)有直接關(guān)系。

本研究中，6-OHDA定位注射造成黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，這與已有的研究報(bào)道一致。隨著病程的進(jìn)展，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎因子導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡［9－10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素和蘆丁的神經(jīng)保護(hù)作用均與其抗氧化、抗炎作用相關(guān)［3－6］。本實(shí)驗(yàn)顯示，MLR可明顯增加TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，并改善細(xì)胞狀態(tài)。另外，GFAP陽(yáng)性計(jì)數(shù)與TH陽(yáng)性計(jì)數(shù)相關(guān)性分析顯示，GFAP細(xì)胞數(shù)與TH細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生與DA能神經(jīng)元凋亡有關(guān)，而MLR可明顯降低GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，提示MLR能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子。

在PD發(fā)病過(guò)程中，各種損傷因素最終通過(guò)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡導(dǎo)致功能障礙，到目前為止還沒(méi)有任何一種藥物或治療方式能夠完全阻斷PD的進(jìn)程。本研究證實(shí)，連續(xù)給藥3周，MLR可以劑量依賴(lài)性減輕大鼠震顫頻率和幅度，表明MLR在減輕模型動(dòng)物震顫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。此外，MLR能夠減輕6-OHDA造成的DA能神經(jīng)元損傷、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子，部分恢復(fù)DA能神經(jīng)元功能，延緩PD病理進(jìn)程。本研究為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(致謝:感謝Thomas P.Lahey先生和 SYNORx，Inc公司提供實(shí)驗(yàn)樣品及在研究過(guò)程中給予的幫助。)

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