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    小鼠局灶性腦缺血模型行為學(xué)指標(biāo)相關(guān)性研究

    2012-12-06 08:03:44劉家蘭鄧禮娟原歡歡徐曉玉
    中國藥理學(xué)通報(bào) 2012年3期
    關(guān)鍵詞:局灶造模腦缺血

    劉家蘭,鄧禮娟,原歡歡,王 琴,徐曉玉

    (西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶市藥效評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

    大腦中動(dòng)脈是臨床上缺血性腦血管病的易患部位,血管閉塞造成局部腦血流循環(huán)障礙[1]。局灶腦缺血模型是目前研究腦缺血疾病的經(jīng)典模型,其成功率高,梗死范圍穩(wěn)定,損傷小,大鼠或者小鼠造模均可,線栓法雖然死亡率高,卻是更適合于長期對腦缺血疾病研究的模型[2]。課題組長期致力于中藥新藥對腦缺血疾病的研究,曾建立過對局灶腦缺血大鼠前肢功能評(píng)價(jià)的一種新方法[3]。本文對藥效學(xué)研究的一種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。國內(nèi)外已有大量關(guān)于線栓法致小鼠局灶腦缺血模型的構(gòu)建方法,其損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)移植于大鼠評(píng)價(jià)體系,但大鼠與小鼠在身體機(jī)能方面有很大差異,評(píng)價(jià)指標(biāo)是否客觀合理有待驗(yàn)證。Bederson等[4]研究認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)體征評(píng)分與腦梗死體積明顯相關(guān),Shen等[5]發(fā)現(xiàn)術(shù)后自發(fā)活動(dòng)與腦梗死體積明顯相關(guān)。本文選取了國內(nèi)外常用的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)方法,以經(jīng)典的Longa等[6]五分法和腦梗死面積百分比為參照,考察線栓法小鼠局灶永久性腦缺血模型行為學(xué)指標(biāo)間的相關(guān)性。以療效確切的血管擴(kuò)張劑葛根素[7],自由基清除劑依達(dá)拉奉[8]治療模型小鼠,觀察所選指標(biāo)能否用于評(píng)價(jià)藥物對該模型的治療作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康KM小鼠150只,體質(zhì)量25~30 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0001],實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(渝)2009-0002,環(huán)境適應(yīng)1周。

    1.2 藥品與試劑 葛根素(純度≥98%,四川玉鑫藥業(yè)有限公司,批號(hào):090602);依達(dá)拉奉注射液(吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):2010050201);水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),2,3,5氯化三苯基四氮唑(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 腦缺血模型的建立 小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后用于模型制備。術(shù)前禁食不禁水12 h,3.5%水合氯醛(35 mg/10 g)ip麻醉;頸部正中切口,剝離并暴露頸動(dòng)脈三角;分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈;用電凝器尖端凝斷頸外動(dòng)脈,在其根部扎口,將線栓(直徑0.10 mm)插入頸內(nèi)動(dòng)脈,當(dāng)栓線標(biāo)記(離頭端1 cm)在頸總動(dòng)脈分叉處,略微感到阻力時(shí)停止插入,固定栓線,縫合皮膚。假手術(shù)組不插入線栓,其余處理同上,造模后3 h進(jìn)行首次神經(jīng)功能評(píng)分,棄掉因失血過多,造模時(shí)間超過15 min者。

    1.4 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)一:小鼠70只,♀♂各半,10只假手術(shù)組,60只用于模型的制備,造模成功的31只用于神經(jīng)功能評(píng)分指標(biāo)的觀察。實(shí)驗(yàn)二:小鼠80只,♂,用于葛根素和依達(dá)拉奉對腦缺血模型的改善效果觀察,將模型成功的63只小鼠隨機(jī)分為模型組、葛根素組和依達(dá)拉奉組,每組21只;剔除造模后d 1~8死亡且無腦缺血病理改變的小鼠,最終用于神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的動(dòng)物為假手術(shù)組10只,模型組10只,葛根素組12只,依達(dá)拉奉組12只;術(shù)后3 h第1次尾iv給藥,每天1次,連續(xù)7 d,假手術(shù)組和模型組尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

    1.5 神經(jīng)功能行為學(xué)測試 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:參照Longa等[6]五分法,術(shù)后 d 1、d 4 和 d 7 對小鼠進(jìn)行評(píng)分。即0分,無神經(jīng)損害癥狀;1.0分,不能完全伸展損傷對側(cè)前肢;2.0分,屈曲姿勢,旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng);3.0分,行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒;4.0分,不能自發(fā)行走,痙攣、昏睡,意識(shí)喪失。

    神經(jīng)綜合功能評(píng)分:參照Petullo等[9]的行為學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)前3 d對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練,包括3個(gè)方面:神經(jīng)肌肉功能、前庭運(yùn)動(dòng)功能和綜合神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能,總分20,分?jǐn)?shù)越高,代表缺血性腦損傷越嚴(yán)重。

    轉(zhuǎn)角試驗(yàn)[10]:將小鼠放在兩塊30 cm×20 cm×1 cm的木板間,兩木板呈30°角,兩板之間有一小縫鼓勵(lì)小鼠進(jìn)入這個(gè)轉(zhuǎn)角,將小鼠面朝轉(zhuǎn)角放置于去轉(zhuǎn)角的半路上,當(dāng)小鼠走進(jìn)轉(zhuǎn)角時(shí),兩邊的觸須會(huì)碰到木板,此時(shí)小鼠會(huì)向前或向上移,最后會(huì)向左或向右轉(zhuǎn)回。腦缺血小鼠會(huì)優(yōu)先向非損傷側(cè)轉(zhuǎn)回,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次,記錄下向右的次數(shù)。

    爬板試驗(yàn)[11]:將小鼠放于一包有銅絲網(wǎng)25 cm×20 cm(孔徑0.2 mm)的有機(jī)玻板上,先保持平板于水平位置,后逐漸豎起平板,直至小鼠不能攀爬而從平板上落下,記錄該時(shí)平板軸線與水平面之間的角度(Holding angle),每只小鼠重復(fù)3次,記平均值。即0 分,≥ 70°;1 分,≥ 65°~69°;2 分,≥ 60°~64.9°;3 分,≥ 55°~59.9°;4 分,<55°。

    1.6 腦梗死灶體積測定 術(shù)后d 8,神經(jīng)功能評(píng)分后,斷頭取大腦,-20℃冷凍8 min,取出沿視交叉冠狀切成約2 mm厚的4個(gè)切片,浸入37℃ 2%TTC溶液中避光染色15 min,4%多聚甲醛固定1 d,濾紙吸干,用小鑷子分開紅色和白色腦組織,稱重,計(jì)算腦梗死質(zhì)量占全腦的百分比。

    2 結(jié)果

    2.1 術(shù)后癥狀及成功率 術(shù)后造模成功小鼠,表現(xiàn)為活動(dòng)減少,左眼微閉,行動(dòng)遲緩,呼吸窘迫,進(jìn)食困難,腹瀉,皮毛豎立,腦損傷對側(cè)前肢卷曲,呈追尾狀轉(zhuǎn)圈等癥狀,從d 1~8體重不斷下降;假手術(shù)組僅左眼微閉,無神經(jīng)功能缺損癥狀,體重變化較小(Fig 1)。實(shí)驗(yàn)一中,60只造模小鼠,8只術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀,2只蛛網(wǎng)膜下腔出血,手術(shù)成功50只,成功率約為83.3%;實(shí)驗(yàn)二中70只造模小鼠,7只術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀,4只蛛網(wǎng)膜下腔出血,手術(shù)成功59只,成功率為84.3%。

    Fig 1 Weight of mouse after operation

    2.2 術(shù)后死亡率 實(shí)驗(yàn)一中50只造模成功小鼠,從d 1~8,總共死亡19只,用于觀察31只,死亡率38%;實(shí)驗(yàn)二中59只造模成功小鼠,從d 1~8,死亡25只,死亡率為42.3%。

    2.3 神經(jīng)功能指標(biāo)的相關(guān)性 對術(shù)后小鼠d 1、d 4和d 7進(jìn)行評(píng)分(Tab 1)。神經(jīng)行為學(xué)與其他指標(biāo)在d 1、d 4和d 7中的相關(guān)性存在差異。結(jié)果顯示,神經(jīng)行為學(xué)與神經(jīng)綜合功能評(píng)分、爬板試驗(yàn)和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)在術(shù)后d 1相關(guān)性最強(qiáng),d 4神經(jīng)行為學(xué)與神經(jīng)綜合功能仍相關(guān),與其他指標(biāo)無相關(guān)性(Tab 2)。

    Tab 1 Neurological function scores of sham and ischemia mice

    2.4 腦梗死百分比與神經(jīng)功能指標(biāo)相關(guān)性 將腦梗死百分比與腦缺血術(shù)后d 7的神經(jīng)功能指標(biāo)評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,腦梗死百分比的大小與神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)綜合功能評(píng)分和爬板試驗(yàn)均相關(guān),與轉(zhuǎn)角試驗(yàn)相關(guān)性差異無顯著性(Tab 3、Fig 2)。

    Fig 2 Correlation between infarction percentage and neurological function indicators

    Tab 2 Correlation efficient between neurologicalbehavioral score and neurological function indicators(n=31)

    2.5 藥物對腦損傷小鼠的作用 根據(jù)以上神經(jīng)功能指標(biāo)的探討,我們選取了神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)綜合功能和爬板試驗(yàn)觀察藥物對腦缺血小鼠的作用。術(shù)后d 1~8陸續(xù)有動(dòng)物死亡,將最終存活下來并具腦缺血病理特征的小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示,葛根素與依達(dá)拉奉組在術(shù)后d 4和d 7腦損傷程度有明顯的改善(Tab 4)。TTC染色顯示梗死區(qū)為白色,正常區(qū)域?yàn)榧t色,假手術(shù)組均呈紅色。模型組梗死區(qū)域較大,占據(jù)大腦皮層及海馬區(qū);與模型組相比,葛根素組和依達(dá)拉奉組梗死面積百分比減小(Tab 5、Fig 3)。

    Tab 3 Correlation efficient between infarction percentage and neurological function indicators(n=26)

    3 討論

    3.1 模型制備的成功要素 小鼠品系:不同小鼠品系造成的損傷程度不同,品系間的梗死體積不同主要是由大腦Willis環(huán)的解剖差異所致。昆明種小鼠不如BALB/c小鼠對腦缺血敏感,但梗死體積穩(wěn)定,且不易死亡[12]。

    Fig 3 Brain TTC staining of mice

    Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

    Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

    **P<0.01 vs sham group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

    Indicator Group Dose/mg·kg-1 n d 1 d 4 d 7 Neurological behavioral scoreSham-100 0 0 Model - 10 2.00 ±0.68** 1.60 ±0.42** 1.50 ±0.42**Puerarin 40 12 2.00 ±0.43 1.17 ±0.58## 1.17 ±0.58##Edaravone 4.5 12 2.08 ±0.52 1.33 ±0.65# 1.08 ±0.52##Neurological comprehensive function score Sham-100 0 0 Model - 10 9.8 ±1.60** 7.80 ±1.42** 6.80 ±0.42**Puerarin 40 12 9.58 ±0.87 6.75 ±0.54## 5.92 ±0.67##Edaravone 4.5 12 9.58 ±1.16 6.63 ±0.71## 6.00 ±0.60##Inclined plane test score Sham - 10 0.20 ±0.42 0.30 ±0.67 0.20 ±0.42 Model - 10 3.00 ±0.67** 2.30 ±0.67** 2.10 ±0.57**Puerarin 40 12 3.00 ±0.85 1.50 ±0.52## 1.42 ±0.51#Edaravone 4.5 12 3.17 ±0.58 1.75 ±0.62## 1.33 ±0.65#

    Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

    Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

    **P <0.01 vs sham group;#P <0.05,##P <0.01 vs model group

    Group Dose/mg·kg-1 n Brain total weight/g Infarction weight/g Inf arction percentage/%Sham - 10 0.32 ±0.03 0 0 Model - 10 0.30 ±0.05 0.05 ±0.02 17.23 ±6.21**Puerarin 40 12 0.29 ±0.05 0.04 ±0.01 14.48 ±3.20#Edaravone 4.5 12 0.30 ±0.04 0.04 ±0.02 13.63 ±4.75##

    體重和性別:小鼠個(gè)體的大小對手術(shù)損傷的耐受力和模型成功與否有一定影響。選取體重為26~30 g小鼠,大小適中,制得的模型均一。術(shù)后小鼠存活率與性別也有很大關(guān)系,♂的耐受性較♀好,存活時(shí)間更長。

    操作過程:造模過程中,盡量避免損傷血管周圍組織和迷走神經(jīng)??捎眯√?hào)針頭在插線端血管扎一小口,插入線栓時(shí)要調(diào)整好進(jìn)線方向,輕柔慢進(jìn),如在10~11 mm的位置遇到阻力,證明線栓進(jìn)入位置正確,若沒有,退出線栓調(diào)整方向再進(jìn)??刹挥脛?dòng)脈夾,在ICA近腦端用縫合線栓個(gè)活結(jié),線栓插入后用鑷子輕輕拉開活結(jié)即可,插入深度不易超過12 mm。

    麻醉劑:麻醉劑對模型的成功影響較大,國內(nèi)常用水合氯醛,易引起呼吸道堵塞。造模過程中,如果遇到呼吸抑制的小鼠,可用小直鑷夾取少許棉花伸入氣管中,取出黏液,同時(shí)節(jié)律性地壓迫心臟,小鼠可快速恢復(fù)正常呼吸,減少死亡率。

    3.2 模型中指標(biāo)的選擇 在腦缺血疾病的觀察中,如何選取能真實(shí)反映疾病程度的指標(biāo)相當(dāng)重要。神經(jīng)功能行為學(xué)指標(biāo)對慢性腦缺血疾病的研究具有重要作用。實(shí)驗(yàn)表明,線栓法制備的小鼠局灶永久性腦缺血模型死亡率較高,腦梗死體積恒定,神經(jīng)功能障礙明顯。Longa評(píng)分與實(shí)驗(yàn)中所選指標(biāo)在短期內(nèi)相關(guān)性強(qiáng),相關(guān)程度隨時(shí)間而降低;腦梗死百分率與多數(shù)指標(biāo)呈正相關(guān)。葛根素、依達(dá)拉奉能明顯降低局灶性腦缺血損傷,表明可通過行為學(xué)指標(biāo)分值預(yù)測腦梗死程度。在行為學(xué)指標(biāo)的定量檢測中,不同指標(biāo)反映不同的功能,神經(jīng)行為學(xué)主要反映前肢功能和偏癱癥狀,不需借助任何設(shè)備,是最為經(jīng)典簡單易行的評(píng)價(jià)方法,分值設(shè)置少間距大,對局灶腦缺血損傷的藥效觀察敏感性較差,可以考慮增加分值數(shù),縮短間距;神經(jīng)綜合功能反映了肌肉運(yùn)動(dòng)功能、前庭運(yùn)動(dòng)功能和平衡綜合能力,與梗死質(zhì)量百分比的相關(guān)性最強(qiáng),對腦缺血疾病的藥效觀察敏感性較高,是較為理想的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法,但評(píng)價(jià)過程較復(fù)雜;爬板試驗(yàn)反映協(xié)調(diào)和平衡能力,與梗死體積的相關(guān)性較強(qiáng),穩(wěn)定且操作簡單,可用于腦缺血疾病的藥效觀察;轉(zhuǎn)角試驗(yàn)用于測定前腦和紋狀體的損傷程度,與梗死質(zhì)量百分比無相關(guān)性,用于藥效的觀察可能需加大樣本量以減少個(gè)體差異。為降低觀察者主觀因素和個(gè)體差異的影響,藥物對腦缺血損傷的評(píng)價(jià),建議加大樣本量和多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。國內(nèi)外關(guān)于小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)指標(biāo)較多,如:煙囪試驗(yàn)[13]、旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)[14]、梯子試驗(yàn)[15]、圓柱體試驗(yàn)[16]、懸掛試驗(yàn)、水謎宮、肌力測試等,分別從腦損傷引起的肌肉、平衡、運(yùn)動(dòng)、記憶和認(rèn)知功能障礙進(jìn)行評(píng)價(jià),對急性腦缺血和長期神經(jīng)功能修復(fù)進(jìn)行觀察,但是否可用于對小鼠永久局灶性腦缺血模型的評(píng)定尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

    3.3 模型的不足 本實(shí)驗(yàn)是將大鼠的線栓法局灶腦缺血模型制備移植于小鼠身上。此模型中需凝斷頸外動(dòng)脈,雖然對神經(jīng)功能缺損的觀察并無影響,但與臨床的腦缺血病理模型有差距,有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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