粗毛纖孔菌產(chǎn)三萜液體發(fā)酵條件優(yōu)化

徐紅云，王占斌

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

粗毛纖孔菌[Inonotus hispidus（Bull.）P.Karst]隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），傘菌亞綱（Agaricomycetidae），刺革菌目（Hymenochaetales），刺革菌科（Hymenochaetaceae），纖孔菌屬（Inonotus），是一種十分珍貴的藥用真菌[1]。在民間常用于治療各種疾病，如在中國(guó)東北用于治療消化不良等胃病[2]，在新疆南部主要用該菌的煎劑治療各種癌癥、糖尿病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等[2]，在加拿大也曾經(jīng)報(bào)道過(guò)其藥用價(jià)值[3]。藥用真菌含有各種生物活性物質(zhì)如生物堿、糖及多糖、甾醇及萜類、皂苷、酚類及鞣質(zhì)、有機(jī)酸、強(qiáng)心苷、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽等成分。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于粗毛纖孔孔菌的生物活性物質(zhì)研究較少，楊修鎮(zhèn)[4]從中分離出麥角淄醇，王占斌[5]研究發(fā)現(xiàn)其子實(shí)體多糖具有提高小鼠免疫功能的作用，而對(duì)于粗毛纖孔菌三萜類物質(zhì)的研究幾乎沒(méi)有。三萜類化合物是廣泛存在于自然界的一類有機(jī)化合物，真菌在發(fā)酵過(guò)程中易產(chǎn)生三萜類物質(zhì)，如Nakamura[6]從樺褐孔菌種中分離羊毛甾烷型inoterpenes A-F；靈芝中含有豐富的靈芝酸[7]；樟芝中含有較多的zhankuicA、B、C等麥角甾烷結(jié)構(gòu)和zhankuicacid D、E等羊毛甾烷兩大結(jié)構(gòu)物質(zhì)[8]等，其中分離出的很多三萜類物質(zhì)具有一定的生物活性，如抗炎活性、抗菌活性和抗腫瘤活性等[9]。本文以粗毛纖孔菌總?cè)飘a(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)其液體發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，從而對(duì)進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)粗毛纖孔菌及提取有效三萜類物質(zhì)，研究其藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌（IH-69） 東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZPQ-400智能氣候培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；Ultrospec 4300pro紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) Amersham公司；STRATOS高速冷凍離心機(jī) Kendro；高壓滅菌鍋 日本SANYO；恒溫水浴箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XT 220A電子天平 Precisa公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化 將4℃保存下的斜面菌種于PDA培養(yǎng)基上活化后，用打孔器均勻截取直徑為12mm的菌絲塊接種于厚度均勻的PDA平板上，28℃培養(yǎng)，再次活化10d；然后再用打孔器均勻截取直徑為12mm的菌絲片3片接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.2 篩選培養(yǎng)基 碳源篩選：3g/L蛋白胨、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4、0.05g/L VB1，pH自然，分別以20g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇和乳糖為碳源，以不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照。

氮源篩選：20g/L葡萄糖、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4、0.05g/L VB1，pH自然，分別以3g/L蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、黃豆粉、硫酸銨和硝酸銨為氮源，以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照。

無(wú)機(jī)鹽篩選：20g/L葡萄糖、3g/L黃豆粉、0.05g/L VB1，pH自然，分別以3g/L MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和 1.0g/L MgSO4·7H2O 加2.0g/L KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，以不加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照。

維生素篩選：20g/L葡萄糖、3g/L黃豆粉、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4，pH自然。分別以0.05g/L VB1、煙酸和VB6為維生素，以不加維生素為對(duì)照。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)綜合1.2.2的單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出最佳的碳源葡萄糖，最佳氮源黃豆粉，最佳無(wú)機(jī)鹽MgSO4·7H2O和KH2PO4及最佳維生素VB1作為參考因子，進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng) 在裝液量為100mL/250mL的三角瓶中，接種量為3片，155r/min，27℃，pH自然的條件下培養(yǎng)10d。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 菌絲生物量的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)液用紗布過(guò)濾，菌絲體用蒸餾水洗滌數(shù)次后在70℃的烘箱中烘干至恒重[10]，精確稱量菌絲干重。

1.4 胞內(nèi)總?cè)坪康臏y(cè)定

粗毛纖孔菌總?cè)坪康臏y(cè)定用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度比色法。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品5mg，溶于50mL無(wú)水乙醇，混合均勻得標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分別置于5mL容量瓶中，在100℃水浴上蒸干后加入0.20mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸搖勻，于70℃水浴保溫反應(yīng)15min后流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量到5mL，搖勻，同時(shí)作試劑空白。在551nm處以試劑空白為參比，用1cm比色皿測(cè)定體系吸光度（OD值）。以白樺脂醇的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.009x＋0.0068，R2=0.9992。

1.4.2 菌絲總?cè)坪康臏y(cè)定 將干燥的粗毛纖孔菌菌絲粉碎，取100mg粉末用5mL 75%的乙醇于70℃水浴鍋中浸提2h，浸提液離心后取0.1mL于5mL容量瓶中，100℃水浴蒸干后比色測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量，得計(jì)算公式如下：

式中，TD為胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量，mg/100mL；Y為測(cè)定的吸光值；G為提取液稀釋倍數(shù)；m為培養(yǎng)菌絲干重，g/100mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對(duì)粗毛纖孔菌胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源的篩選 碳源是構(gòu)成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，同時(shí)供給真菌生長(zhǎng)繁殖所需要的能量及其代謝的調(diào)節(jié)物質(zhì)，真菌能利用的碳源范圍較為廣泛，包括單糖、雙糖、多糖和醇類等[9]。從圖1可知，使用不同類型的碳源，粗毛纖孔菌的菌絲體干重、三萜含量及三萜產(chǎn)量均存在顯著性差異（p＜0.05）。當(dāng)使用葡萄糖作為碳源時(shí)，粗毛纖孔菌的菌絲體干重和總?cè)飘a(chǎn)量均較高，分別為0.75g/100mL和21.07mg/100mL；用蔗糖進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，三萜的含量最高為32.4mg/g；而粗毛纖孔菌對(duì)淀粉、甘露醇和乳糖的利用較差，其菌絲體干重和三萜產(chǎn)量均較低。以高產(chǎn)量的三萜類物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，所以選擇葡萄糖作為最佳碳源。

圖1 不同碳源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source on mycelium dry weight and triterpenoid content，production of inonotus hispidus

圖2 不同氮源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.1.2 氮源的篩選 氮源是構(gòu)成真菌菌體蛋白質(zhì)、核酸及酶類的主要成分，因此對(duì)其需求量也較大。從圖2可以看出，粗毛纖孔菌對(duì)不同氮源的利用存在明顯差異（p＜0.05），且對(duì)有機(jī)氮源的利用明顯高于無(wú)機(jī)氮源。以黃豆粉作為氮源時(shí)，粗毛纖孔菌菌絲體干重，三萜含量和三萜產(chǎn)量均最高，分別為1.21g/100mL、27.5mg/g和33.21mg/100mL；其次為牛肉膏、蛋白胨和酵母粉，對(duì)硝酸銨和硫酸銨的利用均較低。且經(jīng)硝酸銨和硫酸銨誘導(dǎo)后的粗毛纖孔菌三萜含量及產(chǎn)量均低于不添加氮源培養(yǎng)基，說(shuō)明無(wú)機(jī)態(tài)氮源對(duì)三萜類物質(zhì)的代謝起一定抑制作用。本實(shí)驗(yàn)以粗毛纖孔菌的三萜產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)，所以確定黃豆粉為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳氮源。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽的篩選 無(wú)機(jī)離子可作為真菌中多種酶的輔因子，具有穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)膜的作用，有些能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和膨脹壓，參與各種能量反應(yīng)，對(duì)真菌的生長(zhǎng)和代謝起重要作用。從圖3可知，當(dāng)使用MgSO4·7H2O和KH2PO4兩種無(wú)機(jī)鹽共同培養(yǎng)時(shí)，菌絲體的生物量最大，并且總?cè)飘a(chǎn)量為36.02mg/100mL。以不添加無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)CaCl2、KH2PO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O對(duì)粗毛纖孔菌的菌絲體干重和總?cè)飘a(chǎn)量均有一定的抑制作用，可能無(wú)機(jī)鹽添加濃度偏高，抑制菌絲體的生長(zhǎng)和三萜產(chǎn)物的代謝，所以以培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O和KH2PO4兩種無(wú)機(jī)鹽作為最佳篩選結(jié)果。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

圖4 不同維生素對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of vitamin on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.1.4 維生素的篩選 維生素是真菌代謝必不可少的，且屬于不能用簡(jiǎn)單碳源或氮源代替的有機(jī)物，一般其需求量較少。從圖4可以看出，維生素B1、煙酸和維生素B6對(duì)粗毛纖孔菌的生長(zhǎng)存在顯著性差異（p＜0.05），而對(duì)三萜含量無(wú)顯著性影響（p＞0.05），取值范圍在27.31～29.11mg/g。當(dāng)培養(yǎng)基中添加VB1時(shí)效果較好，菌絲體干重達(dá)1.26g/100mL，總?cè)飘a(chǎn)量達(dá)34.57mg/100mL，綜合考慮確定以VB1作為最佳的維生素。

2.2 培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素的篩選結(jié)果，選擇葡萄糖、黃豆粉、無(wú)機(jī)鹽MgSO4·7H2O和KH2PO4及VB1作為參考因子，進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，以確定各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最佳用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of L9（34）orthogonal experiment

由表2可以看出各因素對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生物量的影響主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，對(duì)其胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D，根據(jù)粗毛纖孔菌菌絲生物量篩選的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合是A3B2C3D1，根據(jù)胞內(nèi)三萜產(chǎn)量的篩選的最佳組合是A3B3C3D3。一般菌絲生物量高，胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量就較高[11]，但通過(guò)組合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證A3B2C3D1組合的產(chǎn)量為67.337mg/100mL，A3B3C3D3組合的產(chǎn)量?jī)H為65.259mg/100mL，所以最終選擇A3B2C3D1組合較好，即確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為A3B2C3D1，即葡萄糖40g/L、黃豆粉5g/L、硫酸鎂1.5g/L、磷酸二氫鉀3g/L和維生素B10.05g/L。

2.3 搖瓶發(fā)酵條件對(duì)粗毛纖孔菌胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響

2.3.1 接種量對(duì)胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響 在最佳配比培養(yǎng)液中，選擇接種量為1、2、3、4、5、6片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果如圖5所示。由圖5結(jié)果可知，不同接種量對(duì)粗毛纖孔菌的生物量，三萜含量及三萜產(chǎn)量存在顯著性影響。隨著接種量的增加，粗毛纖孔菌菌絲生物量和總?cè)飘a(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，接種量為5片時(shí)，菌絲體干重最高為2.50g/100mL；接種量為3片時(shí)，胞內(nèi)三萜含量和三萜產(chǎn)量均較高，分別為39.6mg/g和82.95mg/100mL。接種量多于5片時(shí)，菌絲干體重和三萜產(chǎn)量均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明接種量過(guò)多時(shí)，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈抑制菌絲生長(zhǎng)。以胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量為目標(biāo)，因此確定最佳接種量為3片。

圖5 接種量對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculation volume on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.2 搖瓶裝液量對(duì)胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響 裝液量的多少直接影響微生物的供養(yǎng)及發(fā)酵微環(huán)境，過(guò)少則通氣量太大，菌絲生長(zhǎng)緩慢；過(guò)多則通氣量太少，菌絲生長(zhǎng)受限緩慢。本文選擇250mL三角瓶裝液量分別為60、80、100、120、140、160mL，在接種量為3片，pH為6，搖床轉(zhuǎn)速為155r/min，27℃的條件下培養(yǎng)10d。結(jié)果如圖6所示，裝液量低于100mL和高于140mL時(shí)，菌絲體干重和三萜產(chǎn)量均較低，而當(dāng)搖瓶裝液量為100～140mL時(shí)，粗毛纖孔菌的生長(zhǎng)及三萜的代謝相對(duì)較高且較平穩(wěn)。裝液量為100mL/250mL時(shí)，三萜產(chǎn)量高達(dá)81.06mg/100mL，以節(jié)約成本的角度來(lái)看，確定裝液量為100mL/250mL。

圖6 搖瓶裝液量對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of liquid volume on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.3 pH對(duì)胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基的酸堿度影響藥用真菌細(xì)胞膜的功能、細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)、無(wú)機(jī)鹽的溶解性、底物的利用速率、生物量和代謝產(chǎn)物的合成[12]。本文調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為3、4、5、6、7、8，在裝液量為100mL/250mL，接種量為3片，155r/min，27℃的條件下培養(yǎng)10d。從圖7可知，培養(yǎng)基初始pH的大小對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體生物量、胞內(nèi)三萜含量和三萜產(chǎn)量均存在顯著性差異（p＜0.05），中性偏堿或偏酸環(huán)境對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)和三萜類物質(zhì)的代謝起一定抑制作用。當(dāng)pH為6時(shí)菌絲體干重、胞內(nèi)三萜含量和三萜產(chǎn)量均達(dá)到最高值分別為2.41g/100mL、39.56mg/g和95.19mg/100mL，之后隨著pH的升高，菌絲生物量和總?cè)飘a(chǎn)量急劇下降，因此以pH為6作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳pH。

圖7 pH對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of pH value on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間影響菌絲體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的釋放，時(shí)間過(guò)短菌絲生長(zhǎng)慢，代謝產(chǎn)物還未及時(shí)釋放，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易造成菌體自溶，有害物質(zhì)的代謝等。所以選擇裝液量為100mL/250mL三角瓶，在接種量為3片，pH為6，搖床轉(zhuǎn)速為155r/min，27℃的條件下分別培養(yǎng)7、8、9、10、11、12、13d，結(jié)果如圖8所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，粗毛纖孔菌菌絲體干重、胞內(nèi)三萜含量及胞內(nèi)三萜產(chǎn)量均呈現(xiàn)先遞增后降低的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到11d時(shí)，菌絲體干重、三萜含量及三萜產(chǎn)量均達(dá)到最高值，分別為2.20g/100mL、45.88mg/g和100.83mg/100mL。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)于11d后，各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)平緩下降趨勢(shì)，由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，粗毛纖孔菌生長(zhǎng)達(dá)到飽和狀態(tài)后期出現(xiàn)菌絲體自溶，三萜代謝逐漸降低，所以綜合考慮選擇發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為11d較好。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)粗毛纖孔菌產(chǎn)三萜類物質(zhì)的液體發(fā)酵條件進(jìn)行初步篩選，確定其最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為黃豆粉，最佳無(wú)機(jī)鹽為磷酸二氫鉀和硫酸鎂，最佳維生素為VB1。其中以低廉的黃豆粉作為氮源，不僅顯著提高了菌絲體干重和三萜產(chǎn)量，而且節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化粗毛纖孔菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖40g/L，黃豆粉5g/L，硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3g/L和維生素B10.05g/L。后期通過(guò)對(duì)其搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定在接種量為3片，pH為6，裝液量為100mL/250mL三角瓶，轉(zhuǎn)速為155r/min，27℃條件下培養(yǎng)11d，發(fā)酵菌絲生物量可達(dá)2.20g/100mL，胞內(nèi)三萜含量為45.88mg/g，胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量可達(dá)100.83mg/100mL。由于國(guó)內(nèi)對(duì)粗毛纖孔菌研究較少，可通過(guò)與其他藥用真菌比較發(fā)現(xiàn)，粗毛纖孔菌三萜產(chǎn)量較高，如劉華研究樟芝液體發(fā)酵三萜產(chǎn)量為15.25mg/100mL[12]，靈芝發(fā)酵菌絲體為0.1～2mg/g[13]，赤芝單位菌絲體三萜含量為11.3mg/g[14]，所以粗毛纖孔菌具有很高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了很好的基礎(chǔ)。

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