克魯維酵母菊粉酶的酶學(xué)特性研究

孔令堅，石勇，陳雄

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

菊粉是由多個果糖分子通過β－2，1－果糖糖苷鍵連接而成的多聚果糖，末段有一個葡萄糖殘基以α-1，2糖苷鍵與之相連，呈直鏈結(jié)構(gòu)。菊粉廣泛存在于一些菊科植物中，如菊芋、菊苣、大麗花等。其中菊芋是一個廉價的糖源，在我國大部分地區(qū)都有種植，畝產(chǎn)可達3000 kg～5000 kg，通常被作為食用或飼用原料，未獲取其真正的價值，故急待開發(fā)利用[1-3]。

菊粉酶（inulinase，EC3.2.1.7）是一種主要來源于微生物的多糖水解酶，可分為內(nèi)切型、外切型兩種，其中內(nèi)切型菊粉酶可水解菊粉β－2，1-果糖糖苷鍵生產(chǎn)高純度的低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS），外切型菊粉酶可水解菊粉生產(chǎn)超高果糖漿（Ultra High Fructose Glucose Syrups，UHFGS）[4-5]。

本實驗室（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室）分離了一株克魯維酵母S120[6]，可產(chǎn)菊粉酶，本文探討了該克魯維酵母菊粉酶的酶學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1 菌株

克魯維酵母（Kluyveromyces）S120：由本實驗室（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室）篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖20.0 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水定容到1000 mL，pH自然。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

酵母膏10.0 g，蛋白胨20.0 g，菊芋粉10.0 g，蒸餾水定容到1000 mL，pH 6.0。

1.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

在300 mL三角瓶中加入18 g麩皮，2 g菊芋粉，另加入30 mL營養(yǎng)鹽液（0.4%NH4SO4，3%KH2PO4,0.5%MgSO4·7H2O,0.0003%MnSO4·H2O,0.0008%FeSO4·6H2O,0.00025%ZnSO4·7H2O,0.00035%CaCl2），初始 pH5.7。

1.3 方法

1.3.1 接種和培養(yǎng)條件

挑取斜面活化菌種Kluyveromyces S120接入裝有20 mL新鮮種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，30℃下150 r/min培養(yǎng)24 h，按4%接種量接種種子培養(yǎng)液，混合均勻，34℃下培養(yǎng)72 h，間時拍打，使其均勻生長。

1.3.2 酶液的制備與純化

發(fā)酵結(jié)束后，在固體培養(yǎng)物加入1∶10（以干重計）的蒸餾水，于室溫下（25±2）℃攪拌1 h，過濾，重復(fù)提取兩次，合并濾液，濾液作為粗酶液。將粗酶液用50%～60%硫酸銨分級鹽析、陽離子樹脂交換純化得到菊粉酶產(chǎn)品。

1.3.3 菊粉酶的測定

向試管中吸取一定稀釋度的粗酶液1.0 mL，加0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.0）配制的2%菊粉液4 mL，混勻，于60℃保溫30 min后置于沸水中10 min使酶失活，然后冷卻到室溫，產(chǎn)生的還原糖用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定。每個試驗平行3次，試驗結(jié)果取3次的平均值。菊粉酶（I）活力單位規(guī)定為：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol果糖所需的酶量為一個菊粉酶單位（U）。

1.3.4 蔗糖酶的測定

吸取一定稀釋度的粗酶液1.0 mL，加0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 5.0）配制的2%蔗糖溶液4 mL，混合均勻，37℃反應(yīng)30 min。用DNS法測定反應(yīng)液中還原糖的量。以煮沸酶液作對照，每個試驗平行3次，試驗結(jié)果取3次的平均值。蔗糖酶（S）活力單位規(guī)定為：在上述條件下，每分鐘水解1 μmol的蔗糖量。

1.3.5 菊粉酶酶學(xué)特性

1.3.5.1 菊粉酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性

分別以pH 4.5～9.0的緩沖液配制底物和稀釋酶液，測定酶活力，以酶活最高者為100%。將酶分別在pH 4.0～9.0的緩沖液中30℃放置1 h后，測定其殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%。

1.3.5.2 菊粉酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

在不同溫度下測定酶活力，以酶活最高者為100%。在pH5.5條件下，將酶在30℃～60℃范圍內(nèi)保溫1h后，測定其殘余酶活力，以未保溫酶液的酶活力為100%。

1.3.5.3 動力學(xué)常數(shù)測定

酶與底物在pH 5.5、50℃反應(yīng)5 min，測定反應(yīng)產(chǎn)物中還原糖的增加量，以單位時間內(nèi)產(chǎn)物中還原糖的增加量作為酶反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖。

1.3.5.4 金屬離子對酶活力的影響

將酶液對重蒸餾水透析過夜，添加不同金屬離子，測定其酶活力。以不加金屬離子的酶活力為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)、外切型菊粉酶的確定

[7]，對于具有內(nèi)切型、外切型菊粉酶活性的粗酶液，通常測其對2%菊粉溶液的活性（I）和2%蔗糖溶液的活性（S），計算出I/S值，一般認為當(dāng)I/S大于10時，表現(xiàn)為內(nèi)切酶活性。I/S小于10時，表現(xiàn)為外切酶活性。本試驗首先確定Kluyveromyces S120的I/S值為13.5，I/S值大于10，為內(nèi)切菊粉酶菌株。內(nèi)切菊粉酶可水解菊粉產(chǎn)生低聚果糖。

2.2 酶學(xué)特性研究

2.2.1 pH對酶活力的影響

在pH 4.5～9.0條件下，通過多次平行試驗，測定相對酶活力，所得結(jié)果見圖1，將酶分別在pH 4.0～9.0的緩沖液中30℃放置1 h后，通過多次平行試驗，測定其殘余酶活力，結(jié)果見圖2。

圖1 pH對酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on enzyme activity

圖2 pH對酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme stability

從圖1中可知酶的最適pH5.5。低于或高于pH5.5，酶活都有所下降。在pH5.0～pH6.0之間，相對酶活力達90%以上；pH大于7，相對酶活力急劇下降，pH9.0后相對酶活力很低。從圖2中可知該酶在pH 4.5～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，殘留酶活達90%以上。pH影響酶活的原因有：過堿會影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)，甚至使酶變性失活；pH也可能影響酶分子中一些基團的解離，從而影響酶的活性。

2.2.2 溫度對酶活力的影響

在pH 5.5條件下，30℃～60℃范圍內(nèi)通過多次平行試驗，測定相對酶活力，結(jié)果見圖3。將酶分別在30℃～60℃放置1 h后，通過多次平行試驗，測定其殘余酶活力，結(jié)果見圖4。

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on enzyme activity

圖4 溫度對酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme stability

如圖3所示，在溫度為50℃時，酶活力最高。如圖4所示，在50℃～60℃間能維持80%以上的酶活力。溫度對酶促反應(yīng)的影響有兩方面：一方面是當(dāng)溫度升高時反應(yīng)速度會加快；另一方面是隨著溫度的升高，酶逐漸變性。酶的最適溫度是這兩種過程的平衡效果，在低于最適溫度時，前一種效應(yīng)為主，因而酶的活性增加；在高于最適溫度時，后一種效應(yīng)為主，因而酶的活性迅速降低。

2.2.3 金屬離子對酶活力影響

將酶液對重蒸餾水透析過夜，通過添加不同金屬離子，測定其酶活力。不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響見圖5。

由圖5可知，錳離子、鎂離子、鈣離子對菊粉酶的激活作用最顯著，而鋅離子，銅離子，亞鐵離子有抑制作用。

圖5 金屬離子對酶活力影響Fig.5 Effect of metal ion on enzyme activity

2.2.4 米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速度

菊粉酶經(jīng)過初步純化后，在5 min時間內(nèi)，酶量一定及酶促反應(yīng)最適條件下，改變底物濃度（s），測產(chǎn)物濃度（p），初速度設(shè)定為 ΔP/t。按 Lineweaver-Burk作圖法以1/V對1/S作圖，如圖 6，得到 1/V=0.6763（1/S）+0.0636，根據(jù)直線在橫軸上的截距（－1/Km）求出米氏常數(shù)Km為10.63 mg/mL，最大反應(yīng)速度為15.72 mg/（mL·s）。

圖6 底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系Fig.6 Relation of substrate concentration and reaction velocity

3 結(jié)論

克魯維酵母S120菊粉酶為內(nèi)切菊粉酶。其最適pH5.5，最適溫度50℃，錳離子、鎂離子、鈣離子對菊粉酶的激活作用最顯著，而鋅離子，銅離子，亞鐵離子有抑制作用。在試驗條件下，米氏常數(shù)Km為10.63 mg/mL，最大反應(yīng)速度為15.72 mg/（mL·s）。

參考文獻：

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[3]Vandamme E F,Derycke D G.Microbial inulinases:fermentation process,properties and applications[J].Adv Appl Microbiol,1993,29:139-176

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[7]Arhari R.Purification and characterization of endo-and exo-inulinase[J].Biotechnol Biochem,1999,11:105-107