大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

張青峰，劉詠煌

（1.貴州省遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.貴州省遵義醫(yī)學院珠海第五附屬（珠海）醫(yī)院，廣東 珠海 519100）

非酒精性脂肪肝（NAFLD），是一種無過量飲酒史，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。NAFLD現(xiàn)已成為常見肝病之一，疾病隨病程的進展表現(xiàn)不一。日益增多的資料表明，NAFLD患病率正在逐年增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，是全球普遍關注的醫(yī)學問題和社會問題。對于NAFLD目前沒有特效治療法。非酒精性脂肪肝其肝細胞線粒體的β氧化增加，當消耗完體內的抗過氧化物物質時，就容易產生活性氧，氧化應激引起的改變可能在NAFLD中起重要作用。樹莓總黃酮具有很強的抗氧化活性，能夠降低脂肪肝氧化應激水平。本試驗旨在用喂養(yǎng)高脂飼料的方法來建立穩(wěn)定的非酒精性脂肪肝模型，為進一步研究樹莓總黃酮對大鼠非酒精性脂肪肝的防治效果做前期準備。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只（雄性），體重在160～200 g/只，購自廣東省實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為室溫22℃±1℃，濕度為55%±10%。

1.2 飼料 普通基礎飼料購自廣東省實驗動物中心，高脂飼料由82.5%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉組成。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 用普通基礎飼料喂養(yǎng)SD大鼠，一周后，將40只SD大鼠隨機分為兩組，其中正常對照組有10只，模型組有30只。

1.3.2 高脂飼料的制備 首先按照高脂飼料的配方比例稱取相應的量：普通飼料（82.5g/kg）、膽固醇（20g/kg）、豬油（100g/kg）、膽酸鈉（5g/kg）、蛋黃粉（50g/kg）。將普通基礎飼料粉碎，與膽固醇、膽酸鈉、蛋黃粉混勻，再加入液態(tài)的豬油混勻，最后加入適量的水，做成條狀，用烤箱在80℃溫度下烘烤至干，備用。

1.3.3 模型建立 正常對照組飼喂普通基礎飼料，模型組飼喂高脂飼料，每組喂養(yǎng)100g/d，自由飲水，每周稱重一次并記錄。

1.3.4 標本采集 大鼠飼喂12周后，取材之前空腹12h，用5%水合氯醛溶液（0.7mL/100g）將大鼠腹腔注射麻醉，固定后迅速解剖，采集心臟血5mL于抗凝管分裝并標記，將所取的血離心（2 500 r/min，15 min）獲取血清并立即送往遵義醫(yī)學院珠海附屬醫(yī)院進行血清指標檢測。取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈后置于10%甲醛中保存待檢。

1.3.5 肝臟病理學觀察 采血后將大鼠肝臟取出，觀察肝臟的大小、形狀、顏色，并詳細記錄觀察結果。然后從肝小葉上切取一塊肝組織（大約1 cm×1 cm×0.2～0.3 cm）置于10%福爾馬林溶液中固定24h左右，制作成石蠟切片，染色后在顯微鏡下觀察結果。

1.3.6 統(tǒng)計學處理 用SPSS12.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，試驗數(shù)據(jù)用x±s表示。P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠肝臟的一般情況 正常對照組的肝組織形態(tài)正常，顏色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，質地紅潤柔軟。模型組的肝臟體積明顯增大，重量也比正常對照組重，顏色呈棕黃色，肝葉粘連，肝臟切面油膩。

2.2 肝臟指數(shù) 正常對照組和模型組的體重、肝濕重、肝指數(shù)（肝重/體重）結果見表1。與正常對照組相比，模型組體重無明顯變化（P＞0.05），肝濕重和肝指數(shù)顯著增高（P＜0.01）。

表1 SD大鼠的體重、肝濕重、肝指數(shù)比較

2.3 血清指標 模型組血清指標TC、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C含量變化與正常對照組的對比情況見表2。由表2可見，模型組與對照組相比血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組HDL-C水平低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 大鼠各血清指標比較

圖1 模型組肝組織鏡檢觀察結果

2.4 肝臟病理學改變 由病理照片（圖1和圖2）可見，正常對照組的肝小葉結構完整清晰，肝細胞無脂肪變性，細胞核位于細胞中央；模型組的肝細胞體積增大，有大量的空泡狀細胞，肝細胞脂肪變性明顯，細胞核被擠向一邊，部分細胞出現(xiàn)氣球樣變。按照病理學對脂肪肝的分級標準將脂肪肝分為輕度、中度和重度：低倍鏡下，肝細胞脂肪變性占肝小葉1/3～1/2者為輕度脂肪肝；占肝小葉1/2～2/3者為中度脂肪肝；占肝小葉2/3以上或者肝細胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。模型組大鼠的脂肪變性都在中度脂肪肝以上。

圖2 正常對照組肝組織鏡檢觀察結果

3 討論

非酒精性脂肪肝是指除酒精以外的各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積過多的病變，主要病因是由于過多攝入熱量，身體肥胖所致，用高脂飼料造模就是利用了這個原理。從試驗結果看，模型組大鼠的肝臟指數(shù)——肝濕重、肝指數(shù)都明顯高于正常對照組。從病理學角度觀察看，模型組大鼠的肝臟呈棕黃色，切面油膩，肝細胞體積明顯增大，細胞核被擠到一邊，有大量空泡狀細胞，具備人類脂肪肝特征。這些都說明改良的高脂飲食造模成功。

本試驗通過飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了動物非酒精性脂肪肝模型，在造模12周后，模型組的血清指標 TC、TG、ALT、AST、LDL-C 明顯高于正常對照組，HDL-C明顯低于正常對照組，說明檢測血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C、HDL-C 等指標在一定程度上可以反映非酒精性脂肪肝的病變程度。

飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了非酒精性脂肪肝模型，說明本試驗所用的高脂飼料配方對于建立非酒精性脂肪肝模型是可行的，但也有一定的問題。因飼料中摻入了膽固醇、豬油等油膩物質，使飼料性質發(fā)生改變，且有異味，動物易出現(xiàn)“厭食”或腹瀉；另外，造模所需的時間長、病變輕。然而由于該模型制作方法簡便、重復性好、價格低廉、動物死亡率低、復制率高，病變有漸進性發(fā)展過程，造模停止后病變逆轉緩慢便于藥物干預研究，因此仍然是國內外最常用的脂肪肝模型。

4 結論

通過改良的高脂飼料飼喂SD大鼠12周后，進行病理學觀察和血清指標檢測，證明SD大鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功，可以為后續(xù)研究奠定理論和實踐基礎。

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