秦皮乙素對小鼠皮下Hepa1-6肝癌移植瘤凋亡基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Δ

王麗紅，偉忠民（1.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

秦皮為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，以后歷代主要本草均有記載。2010年版《中國藥典》收載了4種秦皮，視為正品，來源為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹F.chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹F.szaboana Lingelsh.或宿柱白蠟樹F.stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮[1]。秦皮乙素（Esculetin）為秦皮的有效成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，秦皮有抗病原微生物、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用[2]。前期體外細(xì)胞試驗證明，秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞有殺傷作用，筆者進(jìn)一步研究秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長的抑制和對相關(guān)凋亡基因的影響，探討其抗癌的相關(guān)機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Napro-6100型CO2培養(yǎng)箱（美國杜邦公司）；YG-875 B型無菌超凈工作臺（上海醫(yī)療器械廠）；KA-1000 C型飛鴿離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；CX21型雙目生物顯微鏡（日本Olympus公司）；WD-9413 B型凝膠成像分析儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；DYY-7 C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Life Express PCR儀（杭州四格生物有限公司）；NANO 2000型紫外分光光度計（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

秦皮乙素（筆者自制，含量：94.47%，平均收率：96.35%）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：09031521，規(guī)格：0.2 g/支）；DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Bcl-2、Bax引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物與細(xì)胞株

C57 BL/6 J小鼠60只，6～8周齡，♂，體重20～22 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（遼）2008-0005）。Hepa1-6細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 復(fù)制模型與分組、給藥

Hepa1-6細(xì)胞、DMEM（高糖）90%、胎牛血清10%置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，0.2%臺昐藍(lán)染色，活細(xì)胞密度＞95%。收集細(xì)胞于PBS中，制成單細(xì)胞混懸液，參照文獻(xiàn)[3]每只小鼠右腋sc 0.2 mL（約1×107個）。模型復(fù)制成功后，小鼠隨機分成5組，即模型（生理鹽水0.2 mL）、CXT（100 mg·kg－1）和秦皮乙素高、中、低劑量（700、400、200 mg·kg－1）組。復(fù)制模型3 d后ip給藥，每天1次，連續(xù)15 d。

2.2 抑瘤率的計算

于末次給藥24 h后，麻醉小鼠取出瘤組織，稱重。抑瘤率（%）＝（1－給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。

2.3 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響

按照試劑盒說明提取總RNA，提取的RNA經(jīng)紫外分光光度儀分別測量260、280 nm波長處吸光度，由260 nm波長處吸光度計算出RNA濃度。按照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴增。凝膠電泳觀察可見18、28S RNA帶。Bax上游引物：5′-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游引物：5′-AGCA AAGTA-AAGAGGGCAACCAC-3′；Bcl-2上游引物：5′-CTCTGGTTGGGATTCCTACGG-3′；下游引物：5′-CGGCATGATCTTCTGTCAAGTTTA-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGTTCCTACCC-CCAATGTGTCCGTC-3′，下游引物：5′-CTGGTCCTCAGTGTAGCC-CAAGATG-3′。反轉(zhuǎn)錄條件：95℃ 加熱5 min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實驗或冷凍貯藏。然后進(jìn)行30個周期的PCR擴增反應(yīng)，PCR擴增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：95℃、5min預(yù)變性1個循環(huán)，每個周期為95℃變性20s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s。取PCR產(chǎn)物10μL與2μL的上樣緩沖液混合，用1×TAE緩沖液配制2%瓊脂糖進(jìn)行水平平板電泳，電壓5 V·cm－1，電泳40 min，在紫外光燈下觀察，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。分別以Bax、Bcl-2與GAPDH比值作為其相應(yīng)的表達(dá)參數(shù)，對Bax mRNA、Bcl-2 mRNA產(chǎn)物相對定量。

2.4 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

將存于－80℃冰箱中的組織解凍，加入裂解液制成勻漿，高速離心后取上清液，測出蛋白含量后加入上樣緩沖液混勻，水浴加熱5 min后－20℃冰箱中保存。灌制10%SDS-PAGE分離膠與濃縮膠于電泳液中進(jìn)行上樣，電泳后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，TBS沖洗，封閉液封閉0.5h加入一抗，4℃過夜，洗膜。加入二抗，室溫下在搖床上雜交1 h，洗膜3次。NBT/BCIP顯色，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描照相。以四星圖像處理系統(tǒng)測定各組蛋白表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH表達(dá)量的比值作為各自表達(dá)水平的參數(shù)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤的抑制作用

秦皮乙素高、中、低劑量組抑瘤率分別為55.42%、40.37%、20.33%，各組瘤重指數(shù)（瘤重指數(shù)＝各組瘤重/小鼠體重）均顯著低于模型組（P＜0.01）。秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用見表1。

表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用（±s，n＝8）Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice（±s，n＝8）

表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用（±s，n＝8）Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice（±s，n＝8）

與模型組比較：＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.01

組別模型組秦皮乙素低劑量組秦皮乙素中劑量組秦皮乙素高劑量組CTX組n 88888劑量/mg·kg－1-200400700100瘤重指數(shù)1.358±0.13021.039±0.0029＊0.772±0.0065＊0.589±0.0013＊0.487±0.0047＊抑瘤率/%-20.33＊40.37＊55.42＊65.03＊

3.2 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響

按照實驗方法中的步驟進(jìn)行提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計測量260和280 nm吸光度的比值均為1.8～2.0。與模型組比較，Bax mRNA表達(dá)隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸增強，顯著高于模型組（P＜0.01），Bcl-2 mRNA的表達(dá)隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸減弱，顯著低于模型組（P＜0.01）。結(jié)果表明，秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤組織Bax基因表達(dá)起到促進(jìn)作用，對Bcl-2基因表達(dá)起到抑制作用。mRNA表達(dá)見圖1。

圖1 mRNA表達(dá)Fig 1 The mRNAexpression

3.3 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

分別檢測不同組中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)量（條帶灰度值），其與內(nèi)參β-actin表達(dá)量的比值為相對表達(dá)量。與模型組比較，秦皮乙素高、中、低劑量組Bax蛋白表達(dá)受到明顯激活，而Bcl-2蛋白表達(dá)受到明顯抑制，與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。蛋白表達(dá)見圖2。

圖2 蛋白表達(dá)Fig 2 The protein expression

4 討論

近年來，從天然動、植物中尋找毒性低、療效高的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前國內(nèi)、外研究的熱點和共識[4]。目前，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的一個重要途徑[5]。中藥的抗腫瘤機制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，許多中藥的有效成分或其提取物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白，分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，Bax是廣泛的促凋亡蛋白。大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生異常時，Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降。過高的抑凋亡蛋白表達(dá)打破了正常細(xì)胞凋亡機制，使癌癥細(xì)胞獲得了生長的優(yōu)勢，對凋亡信號表達(dá)不敏感[7]。在促凋亡因素的刺激下，抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)。通過上調(diào)Bax與Bcl-2比值，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。體外細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素能抑制人肝癌細(xì)胞增殖，阻滯于S期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]。體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果是評價抗腫瘤藥物有效性的重要指標(biāo)，其中移植性動物腫瘤模型具有接種成功率高、實驗周期短、重復(fù)性好等優(yōu)點[9]。所以，本研究選用近交系C57 BL/6 J小鼠sc鼠源Hepa-6細(xì)胞復(fù)制模型。結(jié)果表明，秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長起到不同程度的抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，各劑量組瘤重均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CTX組抑瘤率高于秦皮乙素各劑量組，但與秦皮乙素各組相比小鼠嚴(yán)重消瘦，毛色無光澤，食欲、活動力均下降，出現(xiàn)了化療藥物的不良反應(yīng)。秦皮乙素各組小鼠狀態(tài)良好，其中高劑量組抑瘤率與CTX組相近。RT-PCR、Western blot檢測結(jié)果表明，秦皮乙素促進(jìn)了Bax基因與蛋白的表達(dá)，降低了Bcl-2基因與蛋白的表達(dá)。綜上所述，秦皮乙素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其誘導(dǎo)小鼠肝癌瘤細(xì)胞凋亡的機制之一可能是調(diào)節(jié)凋亡基因Bax/Bcl-2的表達(dá)水平，但具體是哪一種凋亡途徑啟動Bax、Bcl-2基因的表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。

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