穿孔素和顆粒溶素在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中的表達(dá)

李 志，張夢(mèng)瑩，宣 丹，毛桐俊，陸進(jìn)明，徐 亮

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，安徽 蕪湖 241001)

特發(fā)性炎性肌病(IIM)是一組主要以四肢近端肌肉及頸、咽部肌肉受累為主的結(jié)締組織疾病。多發(fā)性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)是IIM最常見(jiàn)的兩種類(lèi)型。近年穿孔素(perforin)和顆粒溶素(granulysin)在炎性肌病的研究日趨增多。本文通過(guò)檢查患者血清穿孔素和顆粒溶素在炎性肌病的表達(dá)從而探討兩者在炎性肌病血清中表達(dá)的差異。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象與分組 選取2010年2月～2011年2月我院收治的初發(fā)PM和DM 20例，均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。其中PM 8例，男性2例，女性6例，平均年齡(47.25±7.36)歲;DM 12例，男性5例，女性7例，平均年齡(47.08±11.28)歲，初發(fā)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎10例，男性4 例，女性 6 例，平均年齡(45.70 ±14.50)歲，正常對(duì)照組8例，男性4例、女性4例，平均年齡(48.50±10.52)歲。在PM和DM組進(jìn)行比較時(shí)，DM組選取10例。將PM和DM整體作為炎性肌病組(20例)與對(duì)照組及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組進(jìn)行兩兩比較，判斷穿孔素和顆粒溶素在以上組間的差異。

1.2 方法 PM/DM患者、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和對(duì)照組均清晨空腹取靜脈血3 ml，分離血清于－20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等由臨床檢驗(yàn)科室以免疫比濁法測(cè)定完成。血清穿孔素和顆粒溶素的測(cè)定，按所購(gòu)買(mǎi)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？瞻讓?duì)照吸光度進(jìn)行調(diào)零，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)的樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組間指標(biāo)的比較以獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)分析，若方差不齊以t'檢驗(yàn);3組間指標(biāo)比較行方差分析，若方差不齊則進(jìn)行秩和檢驗(yàn);炎性肌病組樣本量少，兩變量進(jìn)行秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 穿孔素和顆粒溶素在PM和DM中的比較穿孔素在PM和DM患者血清中表達(dá)水平比較，t'=－0.900，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);顆粒溶素在兩組間比較，t=0.348，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 穿孔素和顆粒溶素在PM和DM的表達(dá)

2.2 穿孔素和顆粒溶素在3組間的比較 穿孔素在炎性肌病組、正常對(duì)照組和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組間無(wú)顯著差異(P＜0.05);顆粒溶素在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和炎性肌病組均高于對(duì)照組(P＜0.05)，而在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和炎性肌病組間無(wú)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。穿孔素進(jìn)行方差分析(F=0.357，P=0.703)，3組間無(wú)差異。顆粒溶素方差不齊行秩和檢驗(yàn)(F=3.873，P=0.03)。炎性肌病組和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組分別與對(duì)照組比較(P＜0.01和 P＜0.05);炎性肌病組和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組間比較(P＞0.05)。

表2 3組穿孔素和顆粒溶素的比較

2.3 穿孔素和顆粒溶素相關(guān)分析 對(duì)20例炎性肌病患者(PM/DM)的穿孔素和顆粒溶素進(jìn)行相關(guān)分析，因樣本量偏小故不能進(jìn)行多因素的相關(guān)及回歸分析，且穿孔素和顆粒溶素非正態(tài)分布，以秩相關(guān)(spearman等級(jí)相關(guān))檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者不存在相關(guān)性(rs=0.018，P ＞0.05)。

2.4 炎性肌病激素敏感與抵抗的比較 隨訪6月發(fā)現(xiàn)5例炎性肌病激素抵抗患者(PM 2例、DM 3例)，選取7例炎性肌病激素敏感患者(PM 3例、DM 4例)進(jìn)行對(duì)比研究。激素敏感與抵抗的標(biāo)準(zhǔn)以Thomas標(biāo)準(zhǔn)判斷［2］。經(jīng)兩組樣本秩和檢驗(yàn)，兩者治療前穿孔素、顆粒溶素、肌力、肌酸激酶無(wú)差異(P＞0.05)。提示穿孔素和顆粒溶素、肌力及肌酶不能預(yù)測(cè)炎性肌病對(duì)激素治療敏感與否。

3 討論

多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中有大量的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，在PM中主要為CD8+T細(xì)胞，該細(xì)胞能分泌大量的穿孔素［3］，PM肌活檢中，與肌細(xì)胞接觸的CD8+T細(xì)胞有43%的細(xì)胞穿孔素呈偏向性分布。而穿孔素在DM的T細(xì)胞中呈彌漫性分布。由此推測(cè)，在DM中T細(xì)胞可能是被非特異性活化，而在PM中T細(xì)胞具有抗原特異性，識(shí)別肌細(xì)胞表面抗原，分泌穿孔素殺傷靶細(xì)胞［4］。日本學(xué)者［5］通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)PM肌肉組織中穿孔素表達(dá)陽(yáng)性的CD8+T細(xì)胞占9.9%，而在DM中很少出現(xiàn)陽(yáng)性。從而推斷穿孔素在PM發(fā)揮著重要的溶解肌細(xì)胞作用。

在體內(nèi)免疫毒性細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的途徑和機(jī)制主要有兩種［6］:①FAS途徑經(jīng)死亡受體起作用;②毒性顆粒途徑。當(dāng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞受到抗原刺激后，被活化并識(shí)別靶細(xì)胞，CTL和NK細(xì)胞內(nèi)胞漿顆粒重定向并移至與效應(yīng)靶細(xì)胞接觸部位，通過(guò)出胞作用以分泌性溶酶體形式將毒性顆粒釋放到細(xì)胞間隙。毒性顆粒成分主要包括穿孔素和顆粒酶。CTL和NK細(xì)胞的溶細(xì)胞顆粒中除了發(fā)現(xiàn)穿孔素、顆粒酶外還有顆粒溶素［7］。顆粒溶素是存在于CTL和NK胞漿顆粒中的溶細(xì)胞蛋白質(zhì)分子，并有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用［8］。顆粒溶素?fù)p傷細(xì)胞的機(jī)制可能是當(dāng)顆粒溶素和靶細(xì)胞帶負(fù)電荷的線粒體膜脂質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致溶解活性發(fā)生［9］。這種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放和線粒體功能的下降，這種改變與穿孔素小孔的形成有關(guān)［10］。Walch 等［11］發(fā)現(xiàn)在穿孔素存在下，顆粒溶素依賴的細(xì)胞溶解作用加強(qiáng)。也就是說(shuō)兩者相互協(xié)同損傷細(xì)胞。我們的研究擬探討炎性肌病患者血清穿孔素和顆粒溶素是否呈高表達(dá)，及兩者是否存在相關(guān)性。本研究通過(guò)對(duì)比炎性肌病組(包括DM和PM)和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組及正常對(duì)照發(fā)現(xiàn):穿孔素在炎性肌病組、正常對(duì)照組和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組間無(wú)顯著差異(P＜0.05);顆粒溶素在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和炎性肌病組均高于對(duì)照組(P＜0.05)，而在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組和炎性肌病組間無(wú)差異(P＞0.05)。提示顆粒溶素在炎性疾病中的意義可能較穿孔素還要重要。一直以來(lái)對(duì)穿孔素的研究主要集中在PM，我們通過(guò)PM組和DM組間t檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)血清中穿孔素和顆粒溶素的表達(dá)在PM和DM存在差異。這與日本學(xué)者［5］通過(guò)免疫組化檢測(cè)CD8+T細(xì)胞中穿孔素表達(dá)結(jié)果不同。

臨床中常遇到激素治療抵抗的患者，如何在治療早期找到預(yù)測(cè)激素抵抗的標(biāo)志物是非常有意義的。Sarwal等［12］在研究激素治療腎移植排斥發(fā)現(xiàn):在激素治療抵抗的移植組織中顆粒溶素染色較激素敏感者高。得出:組織顆粒溶素的致密染色是糖皮質(zhì)激素抵抗的組織標(biāo)志。提示當(dāng)顆粒溶素高表達(dá)時(shí)，可以出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗。Ikezoe等［13］發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性肌炎治療前的活檢標(biāo)本中，激素抵抗患者組織較激素治療敏感患者組織顆粒溶素在CD8+淋巴細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。穿孔素和顆粒溶素在同種顆粒中表達(dá)。雖然糖皮質(zhì)激素抵抗的多發(fā)性肌炎中穿孔素表達(dá)升高，但在糖皮質(zhì)激素抵抗組和敏感組間沒(méi)有顯著差異。這與我們的研究是一致的，我們對(duì)激素敏感與抵抗的炎性肌病患者比較發(fā)現(xiàn)穿孔素的表達(dá)沒(méi)有差異(P＞0.05)。Ikezoe還得出顆粒溶素的表達(dá)和糖皮質(zhì)激素抵抗成正相關(guān)，因而提出:Sarwal［12］將顆粒溶素的表達(dá)可作為腎移植急性排斥激素抵抗的標(biāo)志，那么顆粒溶素也可能作為多發(fā)性肌炎激素抵抗的標(biāo)志。因此我們希望在血清中發(fā)現(xiàn)顆粒溶素與激素抵抗的關(guān)系，但我們?cè)趯?duì)比激素敏感與抵抗的炎性肌病患者中未發(fā)現(xiàn)顆粒溶素表達(dá)存在差異(P＞0.05)，即顆粒溶素尚不能作為預(yù)測(cè)療效的標(biāo)志。這可能與我們的樣本含量偏小有關(guān)。

有學(xué)者［14］提出顆粒溶素和糖皮質(zhì)激素受體多態(tài)性可能是預(yù)測(cè)炎性肌病對(duì)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性有潛在意義的兩個(gè)研究方向。穿孔素和顆粒溶素在炎性肌病免疫損傷中的意義日益受到關(guān)注。

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