以AQP4表達詮釋“肺液”與“腸津”于“肺病及腸”病理傳變中的意義*

孫香蕾 張 亮 吳 碩 李 鋒

（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032）

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)學重要的基礎理論之一，廣泛指導中醫(yī)藥臨床應用。胚胎源［1］、公共黏膜免疫［2-3］、氣體排泄途徑［1，3-4］、神經(jīng)系統(tǒng)［4］、內分泌物 質［5］、腸 源性內毒 素［3，5］、神經(jīng)-內分泌-免疫調控網(wǎng)絡相關［4，6］等研究，部分揭示了“肺與大腸相表里”的生物機制，而中醫(yī)學認為“肺液與腸津”的聯(lián)系亦屬“肺與大腸表里關系”的重要一環(huán)。本文擬觀察“肺病及腸”病變中水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP4）表達變化，冀以探索“肺液與腸津”聯(lián)系的生物學基礎，詮釋“肺與大腸相表里”的部分生物機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量（160±20）g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（軍）2002-005。

1.2 試劑 AQP4兔抗多克隆抗體（ZS-20812），SANTACRUZ公司；免疫組化染色試劑盒（SP-9001），濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032），北京中山金橋生物技術有限公司；大鼠P物質（SP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 （ISC10330EIA-2068R），大鼠血管活性腸肽（VIP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（ISC10330EIA-2643R），北京科盈美科技有限公司。

1.3 分組與造模 將40只SD大鼠隨機分為正常對照組（對照組）與慢性支氣管炎模型組（模型組），各20只。將20只模型組大鼠置于自制81 cm×32 cm×59 cm的煙箱，煙箱上留有16個直徑為1.5 cm×1.5 cm的圓形排氣孔。用煙絲、刨花、鋸末各25 g，點燃熏煙，每次50 min，每日2次，持續(xù)60 d。對照組則置于無煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 標本收集與檢測 于造模第60日將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h新鮮糞便，計算糞水含量。于次日用3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血2 mL，肝素抗凝立即封閉針頭，以3000 r/min，離心10 min后，取上清，-80℃凍存待檢。取左側肺組織行支氣管肺泡灌洗，用生理鹽水洗去表面血漬，用4℃生理鹽水反復灌洗4次，每次灌洗量為4 mL，回收量>80%，4℃，1500 r/min離心 5 min，提取上清液，-80℃凍存待檢。取右肺及近端結腸組織，置于10%甲醛溶液中固定，用于石蠟切片。

1.4.1 糞水含量測定 將收集的新鮮糞便稱質量 （濕質量），用烘箱烘干（75℃、2.5 h），再稱質量（干質量）。計算糞水含量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.4.2 血漿、肺泡灌洗液及肺與結腸組織勻漿中SP與VIP的含量測定 按試劑盒指定的方法進行。

1.4.3 AQP4免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，PBS洗3次各5 min；將切片放入用甲醇新鮮配制的0.3%的雙氧水中，室溫15 min，PBS洗3次各5 min；微波抗原13 min，自然冷卻至室溫，PBS洗3次各5 min；10%正常山羊血清封閉液9 min，甩去，勿洗，滴加稀釋后一抗，4℃過夜，PBS洗4次各4 min；滴加生物素標記二抗，室溫12 min，PBS洗4次各4 min；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶復合物工作液，室溫12 min，，PBS洗4次各4次；加入新鮮配制的DAB顯色液，避光顯色7 min，蒸餾水停止顯色；自來水沖洗10 min；蘇木素襯染胞核2 min，蒸餾水洗去色；鹽酸酒精振洗2次；蒸餾水振洗10次；酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。室溫干燥48 h，顯微鏡觀察并照相。陰性對照以PBS代替一抗染色，步驟同上。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 對照組大鼠精神狀態(tài)好，毛色光澤，排便正常；模型組大鼠精神不振，毛色發(fā)黃，排軟便，糞便呈褐色，出現(xiàn)咳嗽癥狀。

2.2 病理組織觀察 對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡壁無增厚和破壞，氣道黏膜上皮完整，纖毛無粘連脫落，管腔規(guī)整，管壁無增厚，未見炎細胞浸潤；模型組大鼠肺泡壁結構紊亂、增厚，淋巴細胞浸潤，吞噬色素沉著。對照組大鼠近端結腸黏膜上皮腺體與杯狀細胞均正常；模型組大鼠近端結腸有炎細胞浸潤。

2.3 兩組糞水含量比較 與對照組大鼠糞水含量 （10.01±2.48）%相比，模型組（17.21±4.91）%增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 兩組血漿、肺泡灌洗液及肺與近端結腸組織勻漿中SP與VIP的含量比較 見表1，表2。與對照組相比，模型組大鼠血漿、肺泡灌洗液及肺與結腸組織勻漿中SP與VIP的含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 兩組不同部位SP水平比較（μg/μL，）

表1 兩組不同部位SP水平比較（μg/μL，）

組 別 n 血漿 肺泡灌洗液 肺組織勻漿 結腸組織勻漿模型組 20 54.59±6.46 96.07±6.86 91.68±5.52 79.99±7.97對照組 20 53.74±5.68 96.21±3.17 86.06±9.48 81.23±6.88

表2 兩組不同部位VIP水平比較（μg/μL，）

表2 兩組不同部位VIP水平比較（μg/μL，）

組 別 n 血漿 肺泡灌洗液 肺組織勻漿 結腸組織勻漿模型組20 277.85±66.49 481.32±58.86 471.34±24.20 344.96±81.09對照組20 307.91±28.39 418.19±122.33 450.21±57.50 380.44±114.65

2.5 免疫組化染色比較 AQP4表達于氣道黏膜上皮細胞基底側。對照組呈深棕褐色強陽性染色，模型組呈棕褐色陽性染色。其平均光密度值分別為（34.37±5.37）、（22.07±4.32），兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 右肺AQP4表達免疫組化染色（×400）

AQP4位于近端結腸黏膜頂部吸收細胞，且主要分布于基底側與腔面。對照組呈深棕褐色強陽性，模型組呈棕褐色陽性。其平均光密度值分別為（37.23±5.27）、（28.17±3.42），兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 近端結腸AQP4表達免疫組化染色（×400）

3 討 論

“肺與大腸相表里”首載于《內經(jīng)》?！鹅`樞·本輸》篇曰“肺合大腸”；《靈樞·經(jīng)脈》曰“肺手太陰之脈，起于中焦，下絡大腸”，“大腸手陽明之脈……下入缺盆，絡肺下膈，屬大腸”?！胺闻c大腸”通過經(jīng)脈絡屬構成表里配合關系。二者在生理上相互聯(lián)系，主要體現(xiàn)在肺氣肅降與大腸傳導功能之間的相互依存。病理上相互傳變，主要表現(xiàn)為氣機下達不及和易為燥邪所傷。肺和大腸皆喜潤惡燥，其氣以下降為順。《素問·咳論》曰“肺咳不已，則大腸受之”。中醫(yī)學認為“大腸主傳化糟粕、大腸主津”，即“大腸”接受經(jīng)“小腸”泌別清濁所剩下的食物殘渣，吸收其多余水分，形成糞便，傳送至大腸末端，經(jīng)肛門排出體外。若大腸主津液功能失常，則剩余的水液不能吸收，水與糟粕俱下，出現(xiàn)腸鳴、腹痛、腹瀉等癥。

健康成人每日進入胃腸道內的液體多達9 L之多，僅有100 mL的水分隨糞便排出。結腸重吸收水分每日約有2 L，其中水和鈉的吸收主要在右半結腸。若不及時排便，糞便在結腸內停留時間過久，糞便中的水分會被結腸吸收，使得糞便又干又硬，造成排便困難。因結腸黏膜的電阻明顯高于小腸，因此結腸對水的吸收需要借助于載體完成。

AQP4是水通道蛋白家族13種亞型之一，表達于大鼠氣道黏膜上皮細胞基底側，主要功能是調節(jié)氣道表面液體及氣道濕化［7-8］。并且存在于近端結腸黏膜頂部的吸收細胞，以基底面和腔面為主，主要調節(jié)結腸組織對水分的吸收［9］。本研究通過改良煙熏法建立慢性支氣管炎大鼠模型，與對照組大鼠相比，模型組大鼠肺組織中AQP4的表達顯著降低。這一變化可能對黏膜表面水的跨膜轉運和黏膜表面液層的保持有一定影響，長時間煙熏致支氣管黏液分泌增加可能與氣道AQP4降低從而對水的吸收減少有關。與對照組相比，模型組大鼠糞水含量增加且近端結腸組織AQP4表達下降，其糞水含量增加可能與近端結腸AQP4表達下降從而對水的重吸收減少有關。綜上，AQP4可能是“肺液”與“腸津”相關性的分子基礎之一。

另有研究證實，肺和腸道除具有各自的呼吸、消化作用之外，還是一個內分泌器官。由結腸H細胞分泌的VIP能刺激呼吸和松弛血管，誘發(fā)肺通氣過度。如肺合成的VIP可影響腸的血管舒張，并且哮喘的發(fā)作及氣道的反應性均與VIP含量減少有關，VIP含量降低與氣道阻力呈負相［10］。本研究中，兩組相比，大鼠血漿、肺泡灌洗液及肺與結腸組織勻漿中VIP與SP的含量差異無統(tǒng)計學意義。至于二者在“肺病及腸”病理傳變中的地位及作用有待進一步驗證。對于“肺病及腸”在“肺液”與“腸津”方面的更深聯(lián)系，期待以后科研工作者的深入研究。

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