雙酶分步水解法制備棉籽多肽的蛋白酶篩選

林 虬 黃 薇 宋永康 姚清華 蘇德森

雙酶分步水解法制備棉籽多肽的蛋白酶篩選

林 虬 黃 薇 宋永康 姚清華 蘇德森

(福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，福州 350003)

本研究利用6種蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行單酶和雙酶組合水解，測(cè)定水解過程中棉籽蛋白的水解度，同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物的多肽得率進(jìn)行了分析比較。結(jié)果表明，為了高效制備棉籽多肽，可先用Alacalase水解蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行水解，再利用Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解，最終產(chǎn)物的水解度可達(dá)到36．58%，多肽得率達(dá)到71．32%，相比單獨(dú)應(yīng)用Alcalase水解蛋白酶，水解度提高了91．32%，多肽得率提高5．88%。

棉籽蛋白 雙酶分步酶解 水解度 多肽得率

我國是世界上主要產(chǎn)棉大國，2010/11年度我國棉籽產(chǎn)量預(yù)計(jì)將達(dá)到1224萬噸(國家糧油信息中心2010年9月份報(bào)告)，提油后的棉籽粕粗蛋白含量為38%～50%，必需氨基酸含量除蛋氨酸稍低外其余均達(dá)到聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)推薦標(biāo)準(zhǔn)，是一種理想的植物蛋白質(zhì)資源［1］。但長期以來，棉籽粕因含有棉酚等有毒有害物質(zhì)而使其用途受到局限，未能得到很好的開發(fā)利用，造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。隨著棉酚提取工藝和棉籽去毒工藝的日趨完善，棉籽蛋白資源受到了食品工業(yè)和飼料工業(yè)的廣泛關(guān)注，如何進(jìn)一步開發(fā)利用棉籽蛋白資源成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

利用生物催化技術(shù)將低值的蛋白源轉(zhuǎn)化成多肽、寡肽等高值蛋白原料是目前棉籽蛋白質(zhì)開發(fā)利用的新途徑。棉籽蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，分子量減少，結(jié)構(gòu)松弛，更利于人和動(dòng)物體消化吸收，其中的一些多肽片斷還具有獨(dú)特的生理功能，如降血壓、促進(jìn)生長、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等［2］。最近的研究表明［3－4］，單一蛋白酶水解很難在短時(shí)間內(nèi)獲得高水解度、高得率的棉籽多肽，而采用雙酶分步酶解可以顯著提高水解度和多肽得率。因此，選擇合適的工具蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行分步酶解是實(shí)現(xiàn)在較短時(shí)間內(nèi)獲得高水解度高多肽得率棉籽肽的有效途徑之一。本研究選取6種商品化蛋白酶進(jìn)行了水解試驗(yàn)，并對(duì)這些酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕M合，篩選出獲得高水解度高多肽得率的棉籽肽加工用蛋白酶。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

脫酚棉籽蛋白:新疆震企油脂有限公司;Alcalase水解蛋白酶:內(nèi)切肽酶，諾維信公司;Protamex復(fù)合蛋白酶:內(nèi)切酶，諾維信公司;Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶:內(nèi)切酶和外切酶兩種活性，諾維信公司;Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶:金屬中性肽鏈內(nèi)切酶，杰能科公司;胰蛋白酶:內(nèi)切酶，Aeresco公司;木瓜蛋白酶，內(nèi)切酶，福州?？乒尽?duì)苯二甲醛(OPA):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT):Biosharp公司;甲醛、茚三酮、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1．2 主要設(shè)備

Kjeltec2300自動(dòng)凱氏定氮儀:瑞典Foss公司;L－8800氨基酸自動(dòng)分析儀:日本HITICHI公司;U－3900紫外分光光度計(jì):日本Hitachi公司;AL－204電子分析天平:瑞士METTLER TOLEDO公司。

1．3 分析方法

1．3．1 蛋白酶酶活力測(cè)定

蛋白酶的酶活力測(cè)定方法采用Folin－酚法［5］。酶活力的定義為:1 g或1 mL酶制劑在酶反應(yīng)的最適溫度，最適pH的條件下水解棉籽蛋白，1 min產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位。

1．3．2 水解度的測(cè)定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定義是指蛋白質(zhì)水解過程中，被斷裂的肽鍵數(shù)h(mmol/g蛋白質(zhì))與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmol/g蛋白質(zhì))之比。水解度的測(cè)定方法采用鄰苯二甲醛(OPA)法［6］，其計(jì)算公式為:DH=h/htot×100%。

1．3．3 棉籽蛋白總肽鍵數(shù)htot的測(cè)定

棉籽蛋白的htot可以由組成棉籽蛋白的氨基酸含量組成計(jì)算出［7－8］。氨基酸含量組成測(cè)定按GB/T 5009．124—2003進(jìn)行。

1．3．4 多肽得率的測(cè)定

對(duì)特定底物而言，三氯乙酸可以定性地反映蛋白質(zhì)的分解情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽鏈的含量也越高［9］。因此，多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法(TCA－SNI)［10］進(jìn)行檢測(cè)，其計(jì)算公式為:TCA－NSI=N1/N0×100%，式中:TCA－NSI表示三氯乙酸可溶性氮得率/%;N1表示在10%TCA中可溶性氮量;N0表示原料中總氮量。

1．4 試驗(yàn)方法

1．4．1 棉籽蛋白酶解前處理

由于棉籽蛋白的溶解性較差，對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行前處理可以顯著提高水解效果［11］。水解前先對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行粉碎，過篩(過篩粒度控制在60目左右)，然后稱取粉碎棉籽蛋白10．0 g，置于反應(yīng)杯中，按1∶10(g/mL)固液比加入蒸餾水，用1．0%氫氧化鈉調(diào)pH至8，40℃浸提2 h，作為酶反應(yīng)的底物溶液。

1．4．2 單酶水解試驗(yàn)

取經(jīng)過前處理的棉籽蛋白溶液，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)體系pH至酶的最適pH值，加入一定量的蛋白酶，在酶的最適溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別在酶解 0、20、40、60、90、120、150、180 min 時(shí)取樣，取出的樣品溶液置85℃水浴鍋中滅酶10 min，5000 r/min離心20 min，所得上清液即為棉籽蛋白水解產(chǎn)物，保存在4℃待分析用。不同蛋白酶的用量和反應(yīng)條件見表1。

表1 不同蛋白酶的用量和反應(yīng)條件

1．4．3 雙酶組合分步水解試驗(yàn)

根據(jù)單酶水解試驗(yàn)結(jié)果，選取一種蛋白酶作為制備棉籽多肽的主要水解酶，再將主要水解酶與其他5種蛋白酶進(jìn)行組合，其中蛋白酶的組合包括改變兩種酶的作用順序。水解步驟為在一定條件下向棉籽蛋白底物溶液中加入組合中的第1種工具酶，水解150 min后，滅酶，調(diào)溫度、pH再加入第2種工具酶繼續(xù)水解150 min。各蛋白酶的酶解條件按表1進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2．1 脫酚棉籽蛋白的總肽建數(shù)htot

依據(jù)GB/T 5009．124—2003，測(cè)得受試棉籽蛋白18種氨基酸的含量，結(jié)果見表2。從表2可知，脫酚棉籽蛋白的蛋白含量為48．00%，總肽鍵數(shù) htot=359．00 mmol/48．00 g=7．48 mmol/g。

表2 市售棉籽蛋白中的各種氨基酸含量

2．2 蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果

利用Folin－酚法，對(duì)Alcalase水解蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶、Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等6種蛋白酶的酶活力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。測(cè)得的結(jié)果將為水解試驗(yàn)中蛋白酶的添加量提供可靠依據(jù)。

表3 不同蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果

2．3 單酶水解試驗(yàn)

工具蛋白酶的選擇對(duì)于棉籽蛋白資源酶解利用非常重要。不同蛋白酶由于酶切作用方式及酶切位點(diǎn)不同，其對(duì)棉籽蛋白的水解速率、水解度以及多肽得率都有很大的差異。為了選擇合適的棉籽蛋白水解酶，本試驗(yàn)選取了6種分別來源于微生物、植物和動(dòng)物中較有代表性的蛋白酶，以水解度和多肽得率作為指標(biāo)，觀測(cè)各酶對(duì)棉籽蛋白的水解情況。

2．3．1 各酶水解過程中水解度的動(dòng)態(tài)分析

圖1為不同蛋白酶水解棉籽蛋白過程中水解度的變化曲線。從圖1可以看出，在較為適宜的條件下，6種蛋白酶水解棉籽蛋白到達(dá)150 min后，反應(yīng)趨于緩慢，水解度基本不再增加?？紤]到酶促反應(yīng)的特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，整個(gè)水解過程可控制在150 min內(nèi)。在同等酶活力條件下，不同蛋白酶的水解棉籽蛋白的能力還是有顯著差異的。Alcalase水解蛋白酶的水解能力超過其它蛋白酶，最后水解度可達(dá)到19．1%，其次是Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶(15．5%)＞木瓜蛋白酶(15．1%)＞Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶(14．5%)＞Protamex復(fù)合蛋白酶(13．5%)＞胰蛋白酶(11．6%)。

圖1 不同蛋白酶水解過程中水解度變化情況

2．3．2 酶解產(chǎn)物的多肽得率分析

對(duì)不同蛋白酶水解棉籽蛋白所得產(chǎn)物的多肽得率進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。從表4可以看出，Alcalase水解蛋白酶的酶解產(chǎn)物的多肽得率最高(67．4%)，其次是胰蛋白酶(63．1%)Protamex復(fù)合蛋白酶(62．4%)＞木瓜蛋白酶(61．5%)＞Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶(51．6%)＞Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶(45．1%)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)表明，Alcalase水解蛋白酶的酶解產(chǎn)物的多肽得率與其他蛋白酶酶解產(chǎn)物相比差異達(dá)到極顯著水平。

表4 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的多肽得率

綜上，在適宜的條件下Alcalase水解蛋白酶對(duì)棉籽蛋白的水解能力相比其他幾種蛋白酶最強(qiáng)，同時(shí)水解產(chǎn)物中的多肽含量也顯著高于其他水解產(chǎn)物。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可選擇Alcalase水解蛋白酶作為主要水解蛋白酶。

2．4 雙酶組合水解試驗(yàn)

為了獲得高水解度高多肽得率的棉籽肽，將Alcalase水解蛋白酶與其他5種蛋白酶進(jìn)行組合實(shí)行分步酶解，同樣以水解度和多肽得率作為指標(biāo)，觀測(cè)各組合酶對(duì)棉籽蛋白的水解情況。

2．4．1 雙酶分步水解過程中水解度的動(dòng)態(tài)分析

由雙酶組合分步水解的結(jié)果(圖2)可以看出，Alcalase水解蛋白酶與Protamex復(fù)合蛋白酶、Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶組合的試驗(yàn)結(jié)果相似。第1步酶解使用Alcalase水解蛋白酶，第2步采用另一種蛋白酶，所得水解度變化平緩，與A1calase水解蛋白酶單獨(dú)作用相比變化不大。改變兩種酶的作用順序，在終止第1步蛋白酶的反應(yīng)之后，Alcalase水解蛋白酶的加入能夠使水解度繼續(xù)增加，但最終達(dá)到的水解度與前一種水解順序的結(jié)果相似。由單酶水解的結(jié)果可知(圖1)，Alcalase水解蛋白酶的作用效率比較高，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的水解度，致使其他內(nèi)切酶活性的蛋白酶作用位點(diǎn)被水解或遭到了一定程度的破壞［12］。因此，使用Alcalase水解蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)后，加入第2種蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，水解度不會(huì)發(fā)生較大的變化。

由Alcalase水解蛋白酶與Flavourzyme風(fēng)味酶組合反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果來看，兩種順序都能夠使水解度得到較大的提高。先用Alcalase水解蛋白酶，然后再加入Flavourzyme風(fēng)味酶的作用效率要高一些，達(dá)到的水解度(36．6%)比另一種反應(yīng)順序的水解度(29．1%)要高。這說明Alcalase水解蛋白酶的反應(yīng)過程對(duì)Flavourzyme風(fēng)味酶的作用位點(diǎn)的影響相對(duì)其他蛋白酶要小一些。分析原因可能與Flavourzyme風(fēng)味酶具有外切酶活性有關(guān)。

圖2 雙酶分步水解過程中水解度變化情況

2．4．2 雙酶分步水解產(chǎn)物的多肽得率分析

對(duì)雙酶組合分步水解體系所得棉籽蛋白水解產(chǎn)物的多肽得率進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。從圖3中可知，先用Alcalase水解蛋白酶水解再加入Flavourzyme風(fēng)味酶繼續(xù)水解所得產(chǎn)物的多肽得率最高，可達(dá)71．3%;其次為 70．9%、70．8% 等;最低為 63．3%。但差異顯著性檢驗(yàn)表明，產(chǎn)物的多肽得率不存在顯著差異。說明使用雙酶分步水解法，棉籽蛋白水解較為完全，能夠獲得高短肽得率的水解產(chǎn)物。

圖3 雙酶分步水解法棉籽蛋白酶解產(chǎn)物的多肽得率

3 討論與結(jié)論

利用Alcalase水解蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶、Protex．7L細(xì)菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶各單酶體系對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果顯示各蛋白酶在水解150 min之后水解度趨于平緩，其中Alacalase水解蛋白酶與其他蛋白酶相比，反應(yīng)迅速、水解能力(19．1%)最強(qiáng)，短肽得率(67．4%)最大。在實(shí)際應(yīng)用中，可選擇作為棉籽蛋白主要水解蛋白酶。

進(jìn)一步探討雙酶分步水解法酶解棉籽蛋白。研究結(jié)果顯示，雙酶分步水解棉籽蛋白的效果要優(yōu)于單酶體系，水解度和多肽得率均有較大的提高。在水解過程中，酶的加入順序?qū)λ舛鹊淖兓幸欢ǖ挠绊?。最佳的雙酶組合水解方法為:先用Alcalase水解蛋白酶水解150 min，之后再加入Flavourzyme風(fēng)味酶繼續(xù)水解150 min，所得產(chǎn)物的水解度達(dá)到36．6%、多肽得率達(dá)到71．3%。相比單獨(dú)應(yīng)用Alcalase水解蛋白酶，水解度提高了91．3%，多肽得率提高5．9%。劉軍等［13］的研究表明，當(dāng)棉籽蛋白經(jīng)酶水解后其疏水性氨基酸殘基苦味暴露出來，使得到的棉籽多肽帶有明顯的苦味，F(xiàn)lavourzyme風(fēng)味酶能夠?qū)⑽挥陔逆溎┒说氖杷园被釟埢邢?，有效減小棉籽多肽的苦味。綜合水解能力表現(xiàn)，實(shí)際生產(chǎn)棉籽多肽用Alcalase堿性蛋白酶與Flavourzyme風(fēng)味酶進(jìn)行分步水解效果較好。

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Selection of Proteolytic Enzymes to Prepare Cottonseed Peptides by Two－Step－Hydrolysis

Lin Qiu Huang Wei Song Yongkang Yao Qinghua Su Desen
(Fujian Key Laboratory of Precise Measurement of Agricultural Central Laboratory，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003)

6 proteases are used to single and double hydrolyze the cottonseed protein and determine hydrolysis degree of cottonseed protein，as well as analyze and compare the rate of peptides production．The results indicated that the optimal reaction systems were as follows:firstly，Alacalase hydrolysis，then Flavourzyme hydrolysis．Under the optimal system，the degree of hydrolysis 36．58%，cottonseed peptides with the yield of 71．32%were prepared．Hydrolysis degree of protein was increased to 36．5%and the rate of peptides production was 5．88%higher than that of the hydrolysis of cottonseed protein with only Alcalase．

cottonseed protein，two － step － hydrolysis，hydrolysis degree of protein，the rate of peptides production

Q814

A

1003－0174(2012)02－0076－06

福建省公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2010R1027－1)，福建省科技重大專項(xiàng)(2010NZ0002)，福建省農(nóng)科院青年人才創(chuàng)新基金(2010QC－17)

2011－05－19

林虬，男，1963年出生，副研究員，水產(chǎn)生物飼料學(xué)