謝榮華 歐陽珊珊 (湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院,衡陽421005)
HIV/AIDS患者存在免疫缺陷,死亡的主要原因是因為免疫缺陷而導致機會性感染,早期預防及發(fā)現(xiàn)機會性感染可提高和延長HIV/AIDS患者生命。B7-H1(B7-homolog)是新發(fā)現(xiàn)的重要的共刺激分子之一,也稱為程序死亡分子1配體-1(Programmed death-1 ligand-l,PD-L1),B7-H1 主要表達在活化的T淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、B淋巴細胞和部分腫瘤組織。B7-H1主要和程序死亡分子-1(Progrdeath-1,PD-1)結(jié)合傳遞負調(diào)節(jié)信號,導致免疫功能降低[1],Barber等[2]在慢性病毒感染的鼠體內(nèi)注射B7-H1單克隆抗體,即使在CD4+T淋巴細胞耗竭的情況下,亦能改善特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)功能,抑制體內(nèi)病毒載量,改善臨床癥狀。因此,B7-H1在艾滋病免疫發(fā)病機制中起著重要作用。我們觀察HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達變化,并探討其與合并機會性感染的關(guān)系。
1.1 對象 為某院2009年1月至2012年5月HIV/AIDS住院患者42例,年齡25~67歲,平均(45±7)歲,其中男25例,女17例,根據(jù)HIV/AIDS患者是否合并機會性感染,將HIV/AIDS患者分為HIV/AIDS未合并機會性感染組和合并機會性感染組,所有病例均HIV感染確證試驗陽性,符合中華人民共和國HIV/AIDS國家診斷標準[3],排除自身免疫性疾病等,另選擇年齡和性別與病人相匹配的健康對照42名。
1.2 研究方法
1.2.1 HIV/AIDS機會性感染診斷 機會性感染的診斷標準:①確診為HIV/AIDS患者;②具有相關(guān)機會性感染的典型臨床癥狀、體征和輔助檢查表現(xiàn);③臨床標本中或組織病理學檢查證實病原體存在。符合①②者為臨床診斷,符合①②③或①③者為病原學診斷,具體參照2003年美國《成人及青少年HIV感染者機會性感染防治指南》[4]。
1.2.2 主要試劑和儀器 美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀,鼠抗人 Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP均購自美國 BD公司,鼠抗人 B7-H1-PE購自美國eBioscience公司;CD4+T淋巴細胞計數(shù)試劑盒為美國BD公司TriTEST三色試劑。bDNA法檢測HIV-1 RNA病毒載量,儀器為德國Bayer公司System340 bDNA Analyer,試劑盒為德國Bayer公司3.0檢測試劑盒。
1.2.3 Ficoll-Hypaque密度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC) 取新鮮采集的健康人、HIV/AIDS患者靜脈EDTA抗凝全血,1 500 r/min離心10分鐘,取血漿-80℃冰箱凍存。去除血漿后的血用PBS稀釋,充分混勻后,緩慢加至人淋巴細胞分離液液面上,2 500 r/min離心20分鐘;取中間白膜層加至另一離心管中,PBS洗滌2次,得到PBMC。
1.2.4 B7-H1表達水平的流式細胞儀分析 密度梯度法分離HIV/AIDS患者及健康對照外周血單個核細胞并計數(shù)(PBMC),應用以下熒光標記的單抗進行染色,Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、B7-H1-PE并設(shè)同型對照,4℃避光染色30分鐘,加入2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,加入含1%多聚甲醛的PBS重懸,F(xiàn)ACSAria流式細胞儀Diva軟件進行分析。用 FSC、SSC、CD11C、HLA-DR、Lin1定義mDC(mDC表面特征性標志為CD11chighHLADR+Lin 1-),分析這一群細胞B7-H1的表達水平。
1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以±s表示,相關(guān)性采用pearson相關(guān)進行分析,所有檢驗均取P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 HIV/AIDS患者 mDC上 B7-H1表達水平、CD4+T細胞計數(shù)及病毒載量(見表1) HIV/AIDS患者合并機會性感染B7-H1表達水平為23.57%±7.24%,未合并機會性感染者,為9.33%±6.02%,健康對照為0.36%±0.12%。HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表達水平均高于健康對照組,顯示為合并機會性感染者>未合并機會性感染者>健康對照(均P<0.05)。HIV/AIDS患者合并機會性感染CD4+T細胞計數(shù)明顯低于未合并機會性感染組(P<0.05),未合并機會性感染組明顯低于健康對照組(P<0.05);病毒載量,HIV/AIDS患者合并機會性感染明顯高于未合并機會性感染(P<0.05),未合并機會性感染明顯高于健康對照組(P<0.05)。
2.2 HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平與CD4+T細胞數(shù)量及血漿病毒載量的相關(guān)性分析(見圖1、2) HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平,與CD4+T細胞數(shù)量呈顯著負相關(guān)(r=-0.665,P<0.05),而與血漿病毒的載量呈明顯正相關(guān)(r=0.604,P <0.05)。
2.3 HIV/AIDS患者機會性感染發(fā)病率與mDC上B7-H1表達水平的關(guān)系(見表2) 對42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)B7-H1表達水平>30%機會性感染率為100.00%,B7-H1表達水平<10%機會性感染率為28.57%,兩組比較有顯著性差異(P<0.05),42例 HIV/AIDS患者發(fā)生機會性感染31例,總體感染率73.81%,隨著B7-H1表達水平升高機會性感染率增高。
表1 42例成人HIV/AIDS患者與健康對照者mDC上B7-H1表達水平、CD4+T細胞數(shù)量及病毒載量檢測Tab.1 Detection of the level of B7-H1 on mDC ,CD4+T cell absolute counts and plasma viral loads from 42 HIV/AIDS patients and 42 health controls
圖1 HIV/AIDS患者B7-H1表達水平與CD4+T細胞數(shù)量的相關(guān)性Fig.1 Association between level of B7-H1 expression and CD4+T cell counts
圖2 HIV/AIDS患者B7-H1表達水平與病毒載量的相關(guān)性Fig.2 Association between level of B7-H1 expression and plasma viral loads
HIV/AIDS是一種由HIV侵犯CD4+T細胞受損為主要特征的繼發(fā)性細胞免疫缺陷性疾病。HIV在增殖過程中通過直接毒性作用、細胞融合、自身免疫等破壞方式殺傷CD,導致免疫功能低下,進而引起各種病原體如弓形蟲、卡氏肺孢子蟲、結(jié)核、霉菌等感染和腫瘤,導致出現(xiàn)各種感染的綜合征和臨床體征。B7-H1及其受體PD-1屬于負性共刺激分子,兩者相互作用能夠降低T淋巴細胞的免疫功能,同時影響多種Th1和Th2型細胞因子的分泌[5],如下調(diào)IL-2和IFN-γ分泌。最近有多篇關(guān)于病毒感染可以誘導B7-H1和PD-1的表達上調(diào)的報道。陳良恩研究慢性乙型肝炎患者免疫細胞B7-H1表達上調(diào)[6],從而抑制了 T淋巴細胞的功能。Trabattoni等[7]發(fā)現(xiàn)HIV患者外周血淋巴細胞B7-H1表達水平與HIV患者的病情進展有著密切的聯(lián)系,B7-H1表達水平越高,患者的病情越嚴重。本研究對42例HIV/AIDS住院患者進行外周血髓樣樹突細胞(mDC)上B7-H1表達水平檢測,同時檢測外周血CD4+T細胞數(shù)量與病毒載量,結(jié)果顯示,HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表達水平均明顯高于健康對照組,而合并機會性感染者高于未合并機會性感染者,未合并機會性感染者高于健康對照;HIV/AIDS患者合并機會性感染CD4+T細胞計數(shù)明顯低于未合并機會性感染組,未合并機會性感染組明顯低于健康對照組,與國外其他研究者的結(jié)論一致[8];病毒載量合并機會性感染者明顯高于未合并機會性感染,未合并機會性感染者明顯高于健康對照組。HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平,與CD4+T細胞數(shù)量呈顯著負相關(guān),而與血漿病毒的載量呈明顯正相關(guān)。42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平>30%機會性感染率為100.00%,B7-H1表達水平<10%機會性感染率為28.57%,42例HIV/AIDS患者發(fā)生機會性感染31例,總體感染率73.81%,隨著B7-H1表達水平升高機會性感染率增高。提示B7-H1表達與疾病進展關(guān)系密切,是HIV感染疾病進展的標志之一,深入研究B7-H1-PD-1信號途徑對HIV感染免疫功能的影響及調(diào)節(jié)免疫功能的機制,將對理解共刺激分子家族的相互關(guān)系及其復雜性具有重要意義,同時也為闡明HIV感染效應T淋巴細胞免疫耐受的可能機制及臨床免疫治療提供新的思路。綜上所述,B7-H1、CD4+T細胞計數(shù)與機會性感染關(guān)系密切,定期監(jiān)測B7-H1、CD4+T細胞,加強機會性感染的預防,盡可能延長患者的生命和提高患者的生活質(zhì)量。
表2 HIV/AIDS患者機會性感染發(fā)病率與mDC上B7-H1表達水平Tab.2 The relationship between the expression of the B7-H1 on mDC and incidence of opportunistic infection in HIV/AIDS patients
1 Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2004;4(5):336-347.
2 Barber D L,Wherry E J,Masopust D et al.Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J].Nature,2006;439(7077):682-687.
3 Chinese Medical Association.Chinese Center for Disease Control and Prevention guidelines for diagnosisand treatment of HIV/AIDS in China(2005)[J].Chin Med J,2006;119(19):1589-1608.
4 Benson C A,Kaplan J E,Masur H et al.Treating opportunistic infections among HIV-infectin adults and adolescents:recommendations form CDC,the National Instiutes of Health,and the HIV Medicine Association/Infectious Diseases Society of America[J].MMWR Hocomm Rep,2004;53(RR15):1-112.
5 Salama A D,Chitnis T,Imitola J et al.Critical role of the programmed death-1(PD-1)pathway in regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med,2003;198(1):71-78.
6 陳良恩,陳威巍,付寶云et al.B7-H1/PD-1共刺激途徑對慢性乙型肝炎患者HBV特異性淋巴細胞功能的影響[J].中華微生物和免疫學雜志,2007;27(9):826-830.
7 Trabattoni D,Saresella M,Biasin M et al.B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression[J].Blood,2003;101(7):2514-2520.
8 Tansuphaasawedikui S,Amornkui P N,Tanchanpong C et al.Clinical presentation of hospitalized adultpatients with HIV infection and AIDS in Bangkok,Thailand[J].Acquir Immune Defic Syndr,1999;21(4):326-332.