海金子中檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁的分離及含量測(cè)定

彭一波，劉 陽，李 娜，劉玉琴，謝 誼，王實(shí)強(qiáng)

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙410013）

海桐花科（Pittosporaceae） 海桐花屬（Pittosporum Banks）植物海金子（Pittosporum.illicioides Mak.）分布于福建、浙江、江蘇、安徽、江西、湖北、湖南、貴州等省，國外產(chǎn)地有日本[1]。海金子的根民間用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、骨折、胃痛、牙痛、高血壓及神經(jīng)衰弱，還具有良好的殺精子作用[2-3]。海金子葉可用于蛇咬傷，瘡癤腫毒，過敏性皮炎和外傷出血[3]。海金子的干燥種子稱為“山枝仁”，被貴州和四川兩省的地方標(biāo)準(zhǔn)收載，具有清熱利濕、生津止咳、收斂止瀉的功效。用于心煩，口渴咽痛，痢疾，腸炎，白帶，體倦乏力等[4-5]。海金子在四川幾乎都為野生，多生長在懸崖峭壁或斜坡上，采集十分困難，加上利潤微薄，少有人愿意采集，導(dǎo)致商品來源不足。

為了更深入地研究海金子的活性物質(zhì)，從海金子葉中提取、分離得到活性化合物檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁，這兩種化合物在海金子中首次發(fā)現(xiàn)。目前關(guān)于海金子中這兩種化合物的高效液相色譜分析方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了快速預(yù)處理、分離效果好的高效液相色譜分析法，測(cè)定不同采集時(shí)間、海金子不同部位兩種化合物的含量。為開發(fā)和利用海金子提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-10ATvp 高效液相色譜儀（日本島津公司），N2000 雙通道色譜工作站 （浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；島津UV-2450 型紫外分光光度儀（日本島津公司）；INOVA-400 核磁共振儀 （Varian 公司）；Avatar 370 FT-IR 型紅外光譜儀（Thermo Nicolet 公司）；LCQ Advantage 型質(zhì) 譜 儀（Thermo Finnigan 公司）；C10558 型TLC visualizer 成像儀（瑞士卡瑪公司）；SZ-93A 雙蒸餾水器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ2200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240 型分析天平 （METTLER 公司）。

1.2 藥品與試劑

檉柳素-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品（自制），HPLC 測(cè)定含量大于98%；蘆丁對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào)100080-200707）；甲醇、磷酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為雙重蒸餾水。海金子樣品由課題組成員從保靖、吉首、花垣采集，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所生藥室鑒定，為海金子（Pittosporum.illicioides Mak.)全草，取其葉、莖皮、果實(shí)陰干，供樣品含量測(cè)試用。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離

將海金子（花垣8月）葉（500 g）的70%乙醇提取物，依次用石油醚、水飽和正丁醇萃取，回收正丁醇得提取物（3.5 g）。采用硅膠柱進(jìn)行分離，從石油醚∶乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗脫液中得到深黃色顆粒狀晶體，重結(jié)晶得化合物Ⅰ（約200 mg），從乙酸乙酯∶甲醇=（4∶1，V/V） 洗脫液中得到黃色粉末狀結(jié)晶，重結(jié)晶得化合物Ⅱ（約300 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ進(jìn)行UV、1H-NMR、13C-NMR、ESIMS、IR 光譜鑒定，化合物Ⅱ進(jìn)行UV、TLC、HPLC 鑒定。

2.2.1 化合物Ⅰ的波譜數(shù)據(jù)及鑒定

UV λMeOmaxHnm(logε):254(4.32)，356(4.26)，可初步判斷有黃酮化合物基本母核。

ESI -MS m/z：623 [M -H]-。IRνKBrmax/cm：3382，1652，1604，1500，1452，1360，1291。

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.44（d，1H，J=1.6 Hz，H-6），6.21 （d，1H，J=1.6 Hz，H-8），7.86（d，1H，J=1.2 Hz，H-2′），7.52（dd，1H，J=8.4 Hz，1.2Hz，H-6′），6.91（d，1H，J=8.4 Hz，H-5′），3.84（s，3H，4′-OCH3），5.44 （d，1H，J=7.2 Hz，glc-H-1＂），3.22～3.41（m，6H，glc-H-2＂～6＂），0.98 （d，3H，J=6.0 Hz，rha-CH3）。

13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.8（C-2），133.3（C-3），177.7(C-4)，161.5（C-5），99.0（C-6），164.4（C-7），94.1（C-8），156.8（C-9），104.3（C-10），121.4（C-1′)，113.6（C-2′），147.2（C-3′），149.7（C-4′），115.6（C-5′），122.6（C-6′），101.5（C-1＂），76.7（C-2＂），76.2（C-3＂），70.6（C-4＂），74.6（C-5＂），67.1（C-6＂），101.2（C-1＇＇＇），70.4（C-2＇＇＇），70.9（C-3＇＇＇），72.1（C-4＇＇＇），68.6（C-5＇＇＇），18.0（C-6＇＇＇）。以上波譜數(shù)據(jù)與檉柳素-3-O-蕓香糖苷的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[6]一致，故鑒定為檉柳素-3-O-蕓香糖苷。

2.2.2 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定

薄層鑒別：取化合物Ⅱ10.1 mg，用甲醇定容至10 mL，制成化合物Ⅱ溶液；取蘆丁對(duì)照品10.5 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，即得蘆丁對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[7]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，分別以不同的展開劑展開：（1）二氯甲烷∶甲醇∶甲酸（15∶7∶0.5）；（2）三氯甲烷∶甲醇∶水（2∶1∶0.3）下層20 mL 加甲酸0.2 mL；（3）三氯甲烷∶丙酮∶冰醋酸（2∶1.5∶0.2）。展距為15 cm，取出，晾干。置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果化合物Ⅱ溶液的色譜中，在與蘆丁對(duì)照品相應(yīng)的位置處顯黑色斑點(diǎn)。

紫外鑒別：向化合物Ⅱ的甲醇溶液（26.8 μg/mL）分別加入甲醇鈉、乙酸鈉、乙酸鈉/硼酸、三氯化鋁及三氯化鋁/鹽酸診斷試劑，試驗(yàn)數(shù)據(jù)（λmaxnm）：256，266 sh，296 sh，358 （MeOH）；272，328，410 （NaOMe）；272，302 sh，420 （AlCl3）；268，300，366 sh，398（AlCl3/HCl）；272，324，382 （NaOAc）；262，298，378（NaOAc/H3BO3）。將上述各種UV 圖譜與文獻(xiàn)[8]比較，結(jié)果與蘆丁一致。

高效液相色譜鑒別：取蘆丁對(duì)照品適量，制成100 μg/mL 對(duì)照品溶液；取化合物Ⅱ適量，制成100 μg/mL 的化合物Ⅱ試液，在“2.3.1”色譜條件下分別檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)化合物Ⅱ與蘆丁對(duì)照品在相同的保留時(shí)間（15.4 min）出峰。綜上，化合物Ⅱ鑒定為蘆丁。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 采用Agela Technologies Promosil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（34∶66）；流速為1.0 mL/min；檢 測(cè) 波 長 為254 nm；柱 溫 為40 ℃；理論塔板數(shù)按檉柳素-3-O-蕓香糖苷計(jì)不低于5 000。結(jié)果見圖1。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取檉柳素-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品和蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定量稀釋成含檉柳素-3-O-蕓香糖苷100 μg/mL，蘆丁100 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 藥材粉碎（過一號(hào)篩），取粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

圖1 對(duì)照品（A）及海金子藥材葉（花垣8月）供試品（B）HPLC 圖

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密稱取檉柳素-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品和蘆丁對(duì)照品適量，用50%甲醇分別配成每1 mL 含檉柳素-3-O-蕓香糖苷0.254 4 mg和每1 mL 含蘆丁0.340 8 mg 的2 份母液，分別吸取檉柳素-3-O-蕓香糖苷母液2、3、5、7、9 mL于10 mL 容量瓶；分別吸取蘆丁母液2、3、5、7、9 mL 于10 mL 容量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度。分別吸取以上10 個(gè)稀釋液和2 個(gè)母液各5 μL 注入液相色譜儀。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值（mv）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

表1 檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁的線性關(guān)系考察

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取海金子（花垣8月）葉供試品溶液，按上述色譜條件和測(cè)定方法，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁峰面積積分值計(jì)算，RSD 分別為1.71%和1.82%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份海金子（花垣8月）葉供試品溶液，按上述色譜條件和測(cè)定方法，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積，以檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁峰面積積分值計(jì)算，RSD 分別為1.52%和1.73%，結(jié)果表明供試品在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.3.3”方法制備海金子（花垣8月）葉樣品5 份，在“2.3.1”色譜條件下分析，測(cè)得檉柳素-3-O-蕓香糖苷的平均含量為0.54%，RSD為1.76%，蘆 丁 的 平均 含 量 為0.47%，RSD 為1.34%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量的海金子（花垣8月）葉粉末（過一號(hào)篩）12 份，每份0.25 g，分兩組，一組精密加入檉柳素-3-O-蕓香糖苷，另一組精密加入蘆丁對(duì)照品適量，按“2.3.3”方法制備待測(cè)液，各精密吸取5 μL 進(jìn)樣，在“2.3.1”色譜條件下分析測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見表2～3。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取不同采集時(shí)間的海金子葉、莖皮、果實(shí)的粉末（過一號(hào)篩），按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，依照“2.3.1”色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表2 檉柳素-3-O-蕓香糖苷回收率試驗(yàn) （n=6）

表3 蘆丁回收率試驗(yàn) （n=6）

表4 不同采集地、時(shí)間海金子葉、莖皮、果實(shí)中檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量 （n=2，%）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

色譜柱：本實(shí)驗(yàn)分別使用了伊利特Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 柱，Agela Technologies Promosil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm) 柱，Waters Symmetry C18(3.9 mm×150 mm，5 μm)柱，發(fā)現(xiàn) Agela Technologies Promosil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)柱，分離情況較好。

流動(dòng)相的選擇：甲醇-0.2%磷酸[9]，拖尾，適當(dāng)增加磷酸百分含量，甲醇-0.4%磷酸，峰形好。摸索流動(dòng)相比例，甲醇-0.4%磷酸水溶液（34∶66），分離情況較好。

檢測(cè)波長的選擇：檉柳素-3-O-蕓香糖苷的紫外光譜圖有兩個(gè)特征吸收峰，最大吸收波長分別為254 nm 和356 nm。因254 nm 處 的ε 值 大 于356 nm 處的ε 值，故選用254 nm 為檢測(cè)波長。

柱溫的選擇：比較柱溫30、35、40 ℃時(shí)的色譜圖，在40 ℃時(shí)分離度符合要求、理論塔板數(shù)較高。

3.2 樣品處理方法的選擇

提取溶劑考察：取海金子（花垣8月）葉粉末（過一號(hào)篩），8 份，每份0.5 g，分別用不同的溶劑提?。?5%、70%、50%、20%乙醇及100%、70%、50%、20%甲醇，其他提取和測(cè)定條件相同。測(cè)得樣品含量，結(jié)果50%甲醇提取最完全。

提取方法考察：取海金子（花垣8月）葉粉末（過一號(hào)篩），2 份，每份0.5 g，分別回流、超聲30 min，其他提取和測(cè)定條件相同。測(cè)得樣品含量，結(jié)果超聲效果比回流好。

提取時(shí)間考察：取海金子（花垣8月）葉粉末（過一號(hào)篩），4 份，每份0.5 g，分別超聲20、30、45、60 min 放冷，其他提取和測(cè)定條件相同。測(cè)得樣品含量，結(jié)果30 min 樣品可提取完全。

3.3 結(jié)果分析

蘆丁結(jié)構(gòu)鑒定中，由于有中檢所對(duì)照品提供，采用液相色譜結(jié)合薄層色譜進(jìn)行鑒別，比照樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間與Rf 值確定該化合物為蘆??；而檉柳素-3-O 蕓香糖苷無法定對(duì)照品，故選用波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

從表4中可以看出海金子葉、莖皮、果實(shí)中檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量差異顯著，兩個(gè)化合物葉含量最高；不同采集時(shí)間海金子檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁含量差異顯著，其中檉柳素-3-O-蕓香糖苷8月含量較低，蘆丁3月含量較低。本文采用HPLC 測(cè)定幾個(gè)不同采集時(shí)間海金子葉、莖皮、果實(shí)中檉柳素-3-O-蕓香糖苷和蘆丁的含量，為海金子的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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