黃芩總黃酮及黃芩苷對大鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性的研究

嚴(yán)啟新，趙文娟，殷 明，馮漢林，王澤劍*

1深圳市海王生物工程股份有限公司，深圳518057;2上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240

黃芩總黃酮及黃芩苷對大鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性的研究

嚴(yán)啟新1，趙文娟2，殷 明2，馮漢林1，王澤劍2*

1深圳市海王生物工程股份有限公司，深圳518057;2上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240

為觀察黃芩總黃酮及黃芩苷對新生大鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性影響，給SD大鼠灌胃給藥3 d后取含藥血清，分離成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，MTT法檢測成骨細(xì)胞活性，AKP檢測成骨細(xì)胞分化程度，用骨吸收陷窩數(shù)量評價破骨細(xì)胞活性。結(jié)果表明，與對照組相比，含黃芩總黃酮及黃芩苷血清劑量依賴性地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖;其通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的活性，對臨床骨質(zhì)疏松的防治具有積極意義。

黃芩總黃酮;黃芩苷;成骨細(xì)胞;破骨細(xì)胞

骨質(zhì)疏松癥(簡稱為骨質(zhì)疏松)是全身骨骼成分減少的一種骨骼疾病，主要表現(xiàn)為骨組織內(nèi)單位體積中骨量減少，骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)隨年齡的增加(或婦女絕經(jīng)后)等比例的減少，骨組織的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而致其骨組織的正常荷載功能發(fā)生變化。黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)為常用中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。其主要有效成分為黃酮類化合物。目前從黃芩中已發(fā)現(xiàn)40多種黃酮類化合物，其中含量較高并具有明顯藥理作用的是黃芩甙、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩甙。現(xiàn)代藥理研究證明黃芩［1］不僅具有明顯的抗菌消炎、抗過敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒的作用，而且對心血管也具有一定作用?？傊?，黃芩及其所含黃酮有其廣泛的藥理作用，但對其抗骨質(zhì)疏松的研究，在國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，均無抗骨質(zhì)疏松及其相關(guān)的報道。本文，以尼爾雌醇和強(qiáng)骨膠囊為對照，首次觀察了黃芩提取物及黃芩苷對新生大鼠成骨細(xì)胞增殖及分化的影響，探討其對骨質(zhì)疏松的潛在治療作用。

1 藥品、儀器與試驗(yàn)動物

黃芩苷(大于95%，HPLC檢測)、黃芩總黃酮提取物Ⅰ(含量約70%，大孔樹脂制備，UV法測定)、黃芩總黃酮提取物Ⅱ(含量約50%，酸堿制備方法，UV法測定)、黃芩總黃酮提取物Ⅲ(含量約30%，乙醇提取，UV法測定)、黃芩總黃酮提取物Ⅳ(含量約25%，水提取，UV法測定);強(qiáng)骨膠囊(北京岐黃制藥有限公司，0.25 g/粒，批號:031002);尼爾雌醇片(上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，2 mg/片，批號:040301)

儀器:ELX800酶標(biāo)儀美國BioTek公司;I型膠原免疫組化染色試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。

SD大鼠，雌雄各半，體重為200±10 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔級，合格證號:中科動管第004號;許可證號:SCXK(滬)2002-0010。

2 試驗(yàn)方法

2.1 含藥血清的制備［2，3］

選擇SD 3月齡大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為8組，即為對照組(CMC)、尼爾雌醇組、強(qiáng)骨膠囊組、黃芩苷組、黃芩總黃酮提取物Ⅰ組、黃芩總黃酮提取物Ⅱ組、黃芩總黃酮提取物Ⅲ組、黃芩總黃酮提取物Ⅳ組。分別給予1%CMC、各200 mg/kg的黃芩總黃酮提取物組Ⅰ、黃芩總黃酮提取物Ⅱ、黃芩總黃酮提取物Ⅲ、黃芩總黃酮提取物Ⅳ、100 mg/kg的黃芩苷組、強(qiáng)骨膠囊90 mg/kg灌胃給藥，每日給藥2次，連續(xù)給藥1周;尼爾雌醇1 mg/kg每周給藥一次，末次給藥1 h后，心臟采血，靜止1 h后在離心機(jī)上以2000 g離心20 min，合并收集同組血清，56℃水浴滅活30 min，-20℃保存?zhèn)溆?。使用前培養(yǎng)基稀釋，過濾膜除菌(濾膜孔徑為0.22 μm)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)［4］

新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。1日齡的新生SD大鼠拉頸處死，75%酒精浸泡后取頭蓋骨，剔除軟組織后剪碎，加入0.2%的Ⅰ型膠原酶，消化5個循環(huán)，每次20 min，收集第3、4、5次消化的細(xì)胞懸液，800 g離心10 min，棄上清，沉淀的細(xì)胞用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶，于37℃5%CO2孵箱孵育，24 h換液，待細(xì)胞60%～70%貼壁后，用0.25%胰酶消化，即為本實(shí)驗(yàn)的原代成骨細(xì)胞。原代細(xì)胞長成致密單層后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，以1∶3比例傳代，以后每2天換液1次，長成致密單層后用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞鑒定

倒置顯微鏡下觀察:培養(yǎng)第2天大部分細(xì)胞貼壁，貼壁后主要為梭形、圓形或鱗片狀;3～4 d時細(xì)胞突起伸展，相互搭連成片，長滿瓶底時，細(xì)胞為梭形及立方塊狀，排列緊密，并可見圓形及鱗片狀細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見成骨細(xì)胞呈多層生長。

2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［4］

培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(1×105個/mL)，在37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，換含不同濃度、種類的含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，并于結(jié)束培養(yǎng)前4 h，每孔加入10 mg/mL的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO，振搖15 min，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測各空OD值。

2.5 堿性磷酸酶活性測定［5］

旅行商問題(Traveling Salesman Problem,)是路徑規(guī)劃和組合優(yōu)化領(lǐng)域中著名的NP-hard問題[1,2]，網(wǎng)絡(luò)路由的大規(guī)模優(yōu)化[3]、超遠(yuǎn)距離泵送混凝土造價控制技術(shù)[4]、車輛路線設(shè)計[5]等均是典型的TSP。目前，求解TSP的算法可分為精確算法(exact algorithm)和近似算法(approximation algorithm)兩類。Wang等在分析基于智能算法的TSP求解方法優(yōu)缺點(diǎn)[6,7]的基礎(chǔ)上，指出遺傳算法受參數(shù)選擇和數(shù)據(jù)集分布結(jié)構(gòu)的影響最小，陷入局部最優(yōu)的概率最小。

培養(yǎng)板中，每孔加入0.1 mL成骨細(xì)胞懸液(1 ×106個/mL)，貼壁后加藥方法同前，細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，取細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL，各孔均加堿性磷酸酶試劑盒新鮮配制的底物2.55 mL，37℃孵育30 min，雙蒸水空白調(diào)零，在722分光光度計520 nm波長處檢測其吸光度A值。

2.6 骨磨片的制備

取新鮮牛股骨，用鋸式切片機(jī)(Leitz 1600)切割成厚度約50 μm的薄切片，剪成6 mm×6 mm大小，于滅菌的雙蒸水中超聲(SB2200，80W)清洗(50 Hz ×5 min)，連續(xù)3次后，紫外燈照射8 h(每面4 h)，備用［5，6］。

2.7 破骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取1日齡SD大鼠，拉頸處死，75%酒精浸泡5 min，無菌分離四肢長骨，剔凈軟組織，用MEM培養(yǎng)液清洗2次，用解剖刀縱向剖開骨干，將骨質(zhì)內(nèi)表面刮入培養(yǎng)液(MEM全培養(yǎng)液，含20%胎牛血清，100 U/mL硫酸鏈霉素、100 U/mL青霉素鈉，pH 7.2)。再以圓頭吸管吹打骨碎片5 min，靜置30 s，吸取上層細(xì)胞懸液均勻接種于預(yù)置有骨磨片的24孔培養(yǎng)板中，37℃5%CO2孵箱孵育30 min，以MEM培養(yǎng)液沖去未貼壁的細(xì)胞，更換全培養(yǎng)液至每孔2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d更換一次培養(yǎng)液。

2.8 骨吸收陷窩觀察與計數(shù)

培養(yǎng)8 h后，更換為加有含藥血清或?qū)φ昭宓呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)至第7 d，取出所有骨磨片，2.5%戊二醛固定，于0.25 mol/L氫氧化銨超聲波清洗5 min×3次，系列梯度酒精脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍(lán)染液室溫染色，3～4 min，蒸餾水清洗，于光鏡100倍下對整張骨磨片上的吸收陷窩計數(shù)，結(jié)果以陷窩數(shù)/片計。

3 統(tǒng)計處理

4 結(jié)果

4.1 供試藥物血清對成骨細(xì)胞增殖和分化功能的影

結(jié)果見表1及表2，從表1可以看出，與對照組相比，10%黃芩總黃酮提取物血清Ⅰ、10%黃芩總黃酮提取物血清Ⅱ、10%黃芩總黃酮提取物血清Ⅲ、10%黃芩總黃酮提取物血清Ⅳ及5%黃芩苷血清對成骨細(xì)胞增殖具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與對照組相比，20%黃芩總黃酮提取物血清Ⅰ、20%黃芩總黃酮提取物血清Ⅱ、20%黃芩總黃酮提取物血清Ⅲ、20%黃芩總黃酮提取物血清Ⅳ及10%黃芩苷血清對成對成骨細(xì)胞增殖具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。黃芩總黃酮各組及黃芩苷促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用與強(qiáng)骨膠囊相似，顯著優(yōu)于尼爾雌醇組(P＜0.05)。黃芩總黃酮提取物血清和黃芩苷血清濃度提高后，顯著的提高了成骨細(xì)胞增殖能力(P＜0.01)，具有一定的劑量依賴性。

表1 含供試藥物血清對成骨細(xì)胞增殖的影響:A 490 nm(n=7)Table 1 Effects of agents containing serum on the proliferation of osteoblasts:A 490 nm(n=7)

從表2可以看出，與對照組相比，10%、20%含藥血清中黃芩總黃酮各組及黃芩苷對成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01)，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，與強(qiáng)骨膠囊的作用相似;10%黃芩苷血清組促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌AKP的作用顯著優(yōu)于尼爾雌醇組(P＜0.05)。黃芩總黃酮提取物血清和黃芩苷血清濃度提高后，對成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶促進(jìn)作用無明顯提高，提示高濃度的血清可能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞進(jìn)一步分化。

表2 含供試藥物血清對成骨細(xì)胞分泌AKP活性的影響:A 570 nm(n=7)Table 2 Effects of agents containing serum on the activities of AKP secretory from osteoblasts A 570nm(n=7)

本試驗(yàn)結(jié)合成骨細(xì)胞的生長及分化指標(biāo)對黃芩系列藥物進(jìn)行了評價，結(jié)果顯示:它們對成骨細(xì)胞的增殖及分化均有一定的促進(jìn)作用。

4.2 供試品對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

從表3中可以看出，與對照組相比，10%黃芩總黃酮提取物Ⅰ和Ⅳ含藥血清顯著抑制破骨細(xì)胞對骨片的吸收功能，減少骨陷窩形成具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與對照組相比，20%含藥血清中黃芩總黃酮各組及10%的黃芩苷顯著抑制破骨細(xì)胞對骨片的吸收功能，減少骨陷窩形成具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);黃芩總黃酮提取物血清和黃芩苷血清濃度提高后，雖然劑量依賴性的抑制了破骨細(xì)胞對骨片的吸收功能，但不具備統(tǒng)計學(xué)意義，可能與血清本身濃度提高后促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖，進(jìn)而骨陷窩形成增多有關(guān)。

表3 含供試藥物血清對骨片骨陷窩計數(shù)的影響(n=6)Table 3 Effects of agents containing serum on the numbers of absorption lacuna in bone sheets(n=6)

5 討論

本試驗(yàn)在成功培養(yǎng)出成骨細(xì)胞基礎(chǔ)上，觀察了大鼠灌胃給藥后得到的血清對成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。AKP約40%～75%由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，其活性可反映成骨細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，也是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志之一。本試驗(yàn)結(jié)合成骨細(xì)胞的生長及分化指標(biāo)對黃芩系列藥物進(jìn)行了評價，結(jié)果顯示:黃芩總黃酮及黃芩苷對成骨細(xì)胞的增殖及分化均有一定的促進(jìn)作用。與低濃度含藥血清(10%黃芩總黃酮血清或5%黃芩苷血清)相比，高濃度的含藥血清(20%黃芩總黃酮血清或10%黃芩苷血清)顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(P＜0.05)，對成骨細(xì)胞分化和破骨細(xì)胞骨吸收功能雖然有劑量依賴性的提高，但缺乏統(tǒng)計學(xué)差異，可能與血清濃度提高促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖有關(guān)。

本研究利用原代培養(yǎng)的破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收試驗(yàn)。結(jié)果顯示:黃芩總黃酮及黃芩苷對破骨細(xì)胞功能有一定劑量依賴性的抑制作用。說明其防治骨質(zhì)疏松作用，部分是通過抑制破骨細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of Total Flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg and Baicalin Containing Serum on Activities of Osteoblasts and Osteoclasts

YAN Qi-xin1，ZHAO Wen-juan2，YIN Ming2，F(xiàn)ENG Han-lin1，WANG Ze-jian2*1Shenzhen Neptunus Bioengineering Co.Ltd，Shenzhen，Guangzhou 518057;2Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240

To investigate the effects of serum from the total flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg and baicalin fed rats on the activity of osteoblasts or osteoclasts，primary cultured osteoblasts and osteoclasts were isolated from the skull and the limbs of newborn rats respectively.MTT assay was used to evaluate the cell viability.AKP activity was used to evaluate the function of osteoblasts.The numbers of resorption pits on born surface were counted to evaluate the activity of osteoclasts.Compared with control group，the serum containing the total flavonoids of S.baicalensis and baicalin significantly promoted the proliferation of osteoblasts and enhanced the secretion of AKP from osteoblasts after two days incubation.The activities of osteoclasts were also inhibited by the serum containing the total flavonoids of S.baicalensis and baicalint.These results indicated a potential clinical use of total flavonoids of S.baicalensis and baicalin against osteoporosis.

flavonoids of Scutellaria baicalensis Georg;baicalin;osteoblasts;osteoclasts

1001-6880(2012)10-1367-04

2011-09-22 接受日期:2012-02-06

*通訊作者 Tel:86-21-34206836;E-mail:wangzejian@sjtu.edu.cn

R285.5

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