正交試驗(yàn)優(yōu)選葒葉軟膠囊中葒草和山楂葉的提取工藝Δ

張治蓉，黃 勇，鄭 林，王愛(ài)民，王永林（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

正交試驗(yàn)優(yōu)選葒葉軟膠囊中葒草和山楂葉的提取工藝Δ

張治蓉＊，黃 勇#，鄭 林，王愛(ài)民，王永林（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

目的：優(yōu)選葒葉軟膠囊中葒草、山楂葉的提取工藝。方法：分為水提取和醇沉淀2個(gè)步驟，均采用正交試驗(yàn)，以異葒草素+葒草素、金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，總固體物得率的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以加水量、提取時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，優(yōu)選水提取工藝；以異葒草素+葒草素、金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以相對(duì)密度、醇沉濃度、放置時(shí)間為考察因素，優(yōu)選醇沉工藝。結(jié)果：最佳水提工藝為8倍藥材量的水煎煮3次，每次1h；最佳醇沉工藝為藥液濃縮至相對(duì)密度為1.07，醇沉濃度為65%，放置12h。結(jié)論：該提取工藝合理、可行，可用于葒葉軟膠囊中葒草、山楂葉的提取。

提取工藝；葒葉軟膠囊；金絲桃苷；葒草素

葒葉軟膠囊是由葒草、山楂葉等藥材經(jīng)現(xiàn)代制劑技術(shù)加工制成的中成藥，具有活血化瘀、通脈止痛的功放，臨床上用于治療冠心病心絞痛、心血瘀阻證。為提高制劑有效成分含量，降低固形物量，筆者采用正交設(shè)計(jì)，對(duì)加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、醇沉濃度等因素進(jìn)行研究，優(yōu)化葒草、山楂葉水提醇沉工藝。

1 儀器與試藥

LC-10Avp高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-10ATvp輸液泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥（日本島津公司）；WML色譜工作站（廣西威瑪龍色譜科技公司）；TCQ-250超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）。金絲桃苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111521-200303）；異葒草素和葒草素標(biāo)準(zhǔn)品（筆者自制，純度均＞98.0%）；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 生藥吸水量試驗(yàn)

按處方比例稱(chēng)取葒草37.5g、山楂葉30.0g若干份，加10倍量即675mL水，浸泡，于0.5、1.0、2.0、3.0h取出藥材，濾出浸泡液并用量筒量出體積，根據(jù)吸水量計(jì)算藥材的吸水率，至吸水率趨于平衡，此時(shí)的吸水量即為生藥吸水量。結(jié)果，0.5、1.0、2.0、3.0h時(shí)，吸水量分別為105、152、191、196mL，吸水率分別為156%、225%、283%、290%，表明吸水率為300%左右時(shí)趨于平衡，故確定第1次提取時(shí)多加3倍量水。

2.2 葒草素和異葒草素含量測(cè)定[1]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：DiamonsiL C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（15∶85，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；柱溫：40℃；流速：1.0mL·min－1。理論板數(shù)按異葒草素、葒草素峰計(jì)分別為8000、8400。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取異葒草素、葒草素標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于100mL量瓶中，分別用甲醇溶解至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取水煎液、醇沉液適量，置于25mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得異葒草素、葒草素回歸方程分別為Y＝22707X－2709（r＝0.9999）、Y＝21367X+5004（r＝0.9998）。結(jié)果表明，異葒草素、葒草素的檢測(cè)濃度分別在8～128、7.5～120.0μg·mL－1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3 金絲桃苷含量測(cè)定[2]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Lichrospher C18（250mm×4.6mm，5μm）；保護(hù)柱：SecurityGuard C18（3mm×4mm）；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-0.5%冰醋酸溶液（2∶15∶83，V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：363nm；柱溫：40℃；流速：1mL·min－1。理論板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)應(yīng)不低于5000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取金絲桃苷對(duì)照品適量，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取水煎液、醇沉液適量，置于25mL量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

城市綜合樞紐不僅注重多種交通方式的組合，還重視周?chē)鷧^(qū)域城市空間的綜合利用和開(kāi)發(fā)，這就需要政府部門(mén)不斷開(kāi)發(fā)樞紐區(qū)域的土地，以提升土地的整體利用率，將商業(yè)、辦公、居住和娛樂(lè)結(jié)合起來(lái)發(fā)展，形成為旅客提供全過(guò)程服務(wù)的中心。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得金絲桃苷的回歸方程為Y＝16449X+3667（r＝0.9998）。結(jié)果表明，金絲桃苷檢測(cè)濃度在5.5～88.0μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 總固體物的提取

精密吸取已測(cè)定總體積的續(xù)濾液25mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮至近干，于105℃干燥至恒重，稱(chēng)量，計(jì)算總固體物量。

2.5 水提取工藝優(yōu)選

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取加水量（A）、提取時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）為考察因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。提取工藝的因素水平見(jiàn)表1。

表1 提取工藝的因素水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 取葒草75g、山楂葉60g，按表1的安排進(jìn)行試驗(yàn)，照“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定異葒草素+葒草素、金絲桃苷含量，并分別計(jì)算轉(zhuǎn)移率（轉(zhuǎn)移率（%）＝供試品中指標(biāo)成分的量/藥材中指標(biāo)成分的量×100%）和總固體物得率（總固體物得率（%）＝總固體物重量/藥材樣品總重量×100%）。對(duì)上述3個(gè)指標(biāo)分別給予權(quán)重系數(shù)0.4、0.4、0.2，相加即得綜合評(píng)分。提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；提取工藝的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

從表2、表3可知，各因素影響提取效率的順序?yàn)镃＞B＞A，其中煎煮次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)工藝有顯著性影響（P＜0.05），最佳工藝條件為A3B3C3。而A因素對(duì)工藝無(wú)顯著性影響，從提高效率方面考慮，選擇水平1；B因素雖對(duì)工藝有顯著性影響，但其次佳水平與最佳水平的極差轉(zhuǎn)小，從省時(shí)方面考慮，選擇水平2，故選取工藝為A1B2C3。

2.5.3 水提工藝比較試驗(yàn) 為進(jìn)一步證實(shí)該工藝的合理性，按“2.5.2”項(xiàng)下方法對(duì)工藝A3B3C3和A1B2C3進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果，異葒草素+葒草素轉(zhuǎn)移率分別為81.30%、80.25%，金絲桃苷轉(zhuǎn)移率分別為72.72%、70.20%，總固體物得率分別為23.94%、22.36%。2種工藝比較無(wú)明顯差異，而工藝A1B2C3具有低耗能、省時(shí)特點(diǎn)，故選擇此生產(chǎn)工藝，即加藥材重量8倍的水（第1次多加3倍量），煎煮3次，每次1h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，備用。

2.5.4 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取葒草375g、山楂葉300g，共取3份，按優(yōu)選工藝A1B2C3分別進(jìn)行提取，并計(jì)算異葒草素+葒草素、金絲桃苷轉(zhuǎn)移率和總固體物得率。結(jié)果，異葒草素+葒草素平均轉(zhuǎn)移率為80.96%，金絲桃苷平均轉(zhuǎn)移率為71.13%，總固體物平均得率為22.15%，與正交試驗(yàn)結(jié)果最高值相當(dāng)，表明所選工藝穩(wěn)定、可行。

2.6 醇沉工藝的優(yōu)選

2.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取藥液的相對(duì)密度（A）、醇沉濃度（B）、放置時(shí)間（C）為考察因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。醇沉工藝的因素水平見(jiàn)表4。

表2 提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of orthogonal test of extraction technology

表3 提取工藝的方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis of extraction technology

表4 醇沉工藝的因素水平Tab 4 Factors and levels of alcohol precipitation technology

2.6.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 取“2.5.4”項(xiàng)下水煎液，混勻，測(cè)定異葒草素、葒草素、金絲桃苷含量，再取相當(dāng)于葒草75g、山楂葉60g生藥的水煎液9份，按表4安排進(jìn)行試驗(yàn)。照“2.5.2”項(xiàng)下方法測(cè)定異葒草素+葒草素、金絲桃苷提取率，對(duì)上述指標(biāo)分別給予權(quán)重系數(shù)0.5、0.5，相加即得綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選工藝。醇沉工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5；醇沉工藝的方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 醇沉工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of orthogonal test of alcohol precipitation technology

表6 醇沉工藝的方差分析結(jié)果Tab 6Variance analysis of alcohol precipitation technology

從表5、表6可知，各因素影響醇沉效率的順序?yàn)锳＞B＞C，其中相對(duì)密度和醇沉濃度對(duì)工藝有顯著性影響（P＜0.05），最佳工藝條件為A2B2C3。而C因素的最佳工藝和次佳工藝的極差較小，從省時(shí)方面考慮，選擇次佳工藝A2B2C2。

2.6.3 醇沉工藝比較試驗(yàn) 為進(jìn)一步證實(shí)該工藝的合理性，按“2.5.2”項(xiàng)下方法對(duì)工藝A2B2C3和A2B2C2進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果，異葒草素+葒草素轉(zhuǎn)移率分別為81.78%、80.71%，金絲桃苷轉(zhuǎn)移率分別為86.31%、86.74%。2種工藝比較無(wú)明顯差異，而工藝A2B2C2具有低耗能、省時(shí)的特點(diǎn)，故選擇此生產(chǎn)工藝，即煎煮液濃縮至相對(duì)密度為1.07（50℃）、加乙醇使含醇量為65%，攪拌，放置12h，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇，濃縮，備用。

2.6.4 醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取葒草1500g、山楂葉1200g，按水煎煮工藝煎煮，合并濾液，均分為4份，1份照“2.5.2”項(xiàng)下方法測(cè)定異葒草素+葒草素、金絲桃苷提取率，總固體物得率。另3份按醇沉最佳工藝A2B2C2進(jìn)行處理，同法測(cè)定異葒草素+葒草素、金絲桃苷提取率。結(jié)果，異葒草素+葒草素平均轉(zhuǎn)移率為80.24%，金絲桃苷平均轉(zhuǎn)移率為85.82%，總固體物得率為63.75%，與正交試驗(yàn)結(jié)果最高值相當(dāng)，表明醇沉工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)是提取有效成分質(zhì)和量的代表，也是提取物臨床作用性質(zhì)和強(qiáng)度的代表，全面的工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)能夠更客觀、更真實(shí)的評(píng)價(jià)其提取工藝的優(yōu)劣。方中葒草主要含異葒草素、葒草素、牡荊素等成分，具有抗急性心肌缺血、擴(kuò)張血管等作用[3，4]；山楂葉中主要含有金絲桃苷、槲皮素等成分，具有降壓、增加冠脈血流量、清除氧自由基等作用[5，6]。因此，在工藝研究中以異葒草素、葒草素和金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)葒草和山楂葉的水提醇沉工藝進(jìn)行探討。工藝驗(yàn)證結(jié)果表明，葒草、山楂葉中黃酮類(lèi)代表成分平均轉(zhuǎn)移率均＞60%，其轉(zhuǎn)移率較高，穩(wěn)定性好，說(shuō)明本提取工藝穩(wěn)定、可行。

[1] 萬(wàn)先倫，馬 琳，王永林，等.HPLC測(cè)定葒葉心通軟膠囊中異葒草素、葒草素的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（16）：722.

[2] 劉麗娜，李勇軍，何 迅，等.高效液相色譜法測(cè)定葒葉心通軟膠囊中金絲桃苷含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（10）：25.

[3] 付曉春，王敏偉，李少鵬，等.葒草苷對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22（1）：45.

[4] 謝周濤，何再安，劉眾文.葒寥的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（1）：1034.

[5] 李卓恒，孟德勝，盧來(lái)春，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選貫葉金絲桃中金絲桃苷的乙醇提取工藝[J].中國(guó)藥房，2011，22（11）：992.

[6] 李慶林，俞桂新，陳志武，等.金絲桃苷對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37（11）：829.

Optimization of Extraction Technology of Polygonum orientale and Crataegi Folium from Hongye Soft Capsule

ZHANG Zhi-rong，HUANG Yong，ZHENG Lin，WANG Ai-min，WANG Yong-lin（School of Pharmacy，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Polygonum orientale and Grataegi Folium from Hongye soft capsule.METHODS：Extraction process included water extraction and alcohol precipitation，and orthogonal experiments were carried out.The water extraction technology was optimized with amount of added water，extraction time and decoction times as factors using transfer rate of isorientin，orientin，hyperoside and the yield of total solid as evaluation index；the alcohol precipitation technology was optimized with relative density，concentration of alcohol precipitation and setting time as factors using transfer of isorientin，orientin，hyperoside as index.RESULTS：The optimal water extraction condition was as follows：8-fold water，extracting for 3times，1hour for each time.The optimal alcohol precipitation condition was as follows：the relative density of 1.07，the concentration of alcohol precipitation 65%and storing for 12hours.CONCLUSION：The extraction technique is reasonable and feasible，which can be used for the extraction of P.orientable and Crataegi Folium from Hongye soft capsule.

Extraction technology；Hongye soft capsule；Hyperoside；Orientin

R284.2；R2883.621

A

1001-0408（2012）35-3297-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.11

Δ貴州省科技計(jì)劃課題（黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2007]6010、黔科合計(jì)工字[2009]4001）

＊碩士研究生。研究方向：天然藥物藥動(dòng)學(xué)與新藥活性評(píng)價(jià)。電話(huà)：0851-6908899。E-mail：zzr616@126.com

#通訊作者：副教授。研究方向：中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)，藥動(dòng)學(xué)，藥物新劑型、新技術(shù)。E-mail：mailofhy@126.com

2011-11-17

2012-04-17）