黃曲霉菌株的分離、鑒定及產(chǎn)毒能力分析

楊生瑞 屈凌波 孫長坡 沈 晗 沈 瑾 伍松陵

黃曲霉菌株的分離、鑒定及產(chǎn)毒能力分析

楊生瑞1，2屈凌波1孫長坡2沈 晗2沈 瑾3伍松陵2

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院1，鄭州 450001)
(國家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)
(農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所3，北京 100126)

對幾株從發(fā)霉糧食中分離出的黃曲霉菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)毒能力的HPLC測定。結(jié)果表明:試驗(yàn)分離菌株均為黃曲霉菌株且含有黃曲霉毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵基因aflR;黃曲霉菌株之間產(chǎn)毒能力差異巨大:黃曲霉菌株3．4408產(chǎn)毒量最高，黃曲霉菌株HDWS產(chǎn)毒量最低，黃曲霉菌株3．2572甚至不產(chǎn)生黃曲霉毒素;產(chǎn)生黃曲霉毒素菌株中部分黃曲霉菌株產(chǎn)生4種黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，黃曲霉菌株HDWH只產(chǎn)生黃曲霉毒素AFB1、AFB2。

黃曲霉菌 黃曲霉毒素 aflR基因 高效液相色譜

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是所有真菌毒素中對環(huán)境污染最嚴(yán)重，對人畜危害最大且毒性最強(qiáng)的真菌次級代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素既有很強(qiáng)的急性毒性，導(dǎo)致肝臟壞死出血，使免疫系統(tǒng)受損，引起蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良癥并導(dǎo)致兒童發(fā)育受阻，也有明顯的慢性毒性引起肝癌，并具有致癌、致畸、致突變作用，對人、家畜和家禽的健康威脅極大，因此受到世界范圍的廣泛關(guān)注。研究表明有7種曲霉屬真菌可產(chǎn)黃曲霉毒素，分別為:Aspergillus flavus，A．parasitieus，A．nomius，A．Pseudot－amarii，A．bombycis，A．ochraceorosens及一種分離自西非的未定名分類元，最主要是由黃曲霉(Aspergillus flavus，A．flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus，A．paras－iticus)以玉米、花生和堅(jiān)果等農(nóng)作物及其制品為主產(chǎn)生的一類劇毒且致癌的代謝產(chǎn)物［1－3］，主要包括:黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素B2(Aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)和黃曲霉毒素G2(Aflatoxin G2，AFG2)，其中AFB1是毒性最強(qiáng)的致肝癌毒素。黃曲霉毒素不僅對人類健康危害極大，而且通過污染農(nóng)作物給國民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。鑒于其危害性很大，因此各國都制定了黃曲霉毒素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)以保障消費(fèi)者的健康。中國規(guī)定了除玉米、花生及其制品外，絕大多數(shù)食品中的黃曲霉毒素AFB1的含量均不超過5μg/kg;歐盟規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最高限量為4μg/kg;美國規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最高限量為15μg/kg。

黃曲霉毒素生物合成過程非常復(fù)雜，共涉及21步酶促反應(yīng)［4］。參與黃曲霉毒素合成的絕大多數(shù)基因聚集于一個(gè)特定的基因簇中，由基因簇中各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而成［5］?；虼噩F(xiàn)象在次生代謝產(chǎn)物合成中比較常見［6］?；虺纱卮嬖谝彩屈S曲霉毒素合成途徑等次生代謝途徑的重要調(diào)控機(jī)制之一［7］。黃曲霉毒素生物合成途徑的調(diào)節(jié)基因aflR在黃曲霉毒素產(chǎn)生過程中具有十分重要的作用，aflR基因的表達(dá)產(chǎn)物AflR蛋白是一個(gè)鋅簇轉(zhuǎn)錄因子，能夠開關(guān)黃曲霉毒素途徑的其他基因轉(zhuǎn)錄，是黃曲霉毒素合成的關(guān)鍵蛋白［8］，aflR基因的轉(zhuǎn)錄中斷可能抑制其他黃曲霉毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)［9］。由于AflR蛋白是黃曲霉毒素生物合成途徑中的主要正轉(zhuǎn)錄因子［8］，大多數(shù)黃曲霉毒素合成相關(guān)基因受AflR蛋白的調(diào)節(jié)［10］，除了estA基因外，黃曲霉毒素的生物合成途徑中相關(guān)酶基因的表達(dá)都受到AflR蛋白的正調(diào)節(jié)［11］。

目前，針對黃曲霉毒素的檢測方法主要有高效薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜(HPLC)法、熒光計(jì)和酶聯(lián)免疫(ELISA)法、樣品前處理方法中也多采用免疫親合柱(IAC)或多功能固相萃取柱進(jìn)行純化處理。試驗(yàn)研究用IAC純化、在線光化學(xué)衍生化、HPLC法配熒光檢測器測定篩選獲得的黃曲霉菌株是否產(chǎn)生黃曲霉毒素［12］，以期為解析黃曲霉菌污染的特點(diǎn)和開發(fā)黃曲霉毒素防控技術(shù)提供幫助。

1 材料和方法

1．1 材料

所用菌株為Aspergillus flavus 3．4408和3．2572，購自中國微生物菌種保藏中心;Asperg－illus flavus HDWS、HDWH和ASAG3三株黃曲霉菌為本試驗(yàn)篩選獲得;大腸桿菌JM109，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所惠贈。

1．2 儀器和試劑

DNA聚合酶(KOD－Plus):TOYOBO公司;DNA Marker DL2000，TaKaRa公司;DNA連接酶(PMD 19－T Vector):TaKaRa公司;快速定性濾紙;免疫親合柱;64R型冷凍離心機(jī):BECKMAN公司;N．Y．10018，U．S．A光化學(xué)衍生器:AURA公司;1100型高效液相色譜儀配熒光檢測器:Agilent公司;ABI PCR擴(kuò)增儀:美國Applied Biosystems公司:高速震蕩器;氮?dú)獯蹈蓛x;六位泵流操作架。

所用水為雙蒸水和超純水;甲醇、乙腈:色譜純，迪馬公司;甲醇、二氯甲烷、正己烷、氯化鈉:分析純，北京化工廠;黃曲霉毒素B1、B1、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液:純度＞99%，Sigma公司。

1．3 方法

1．3．1 菌株分離方法

稱取黃曲霉毒素超標(biāo)的發(fā)霉玉米和小麥各10 g，用100 mL無菌水?dāng)噭蜃鳛樵?，然后吸? mL依次稀釋為10－1至10－88個(gè)濃度梯度。分別取各濃度的稀釋液200μL涂布于察氏培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)6 d。劃線分離得到單菌落，以黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株3．4408對照，在熒光顯微鏡下觀察進(jìn)行孢子的形態(tài)學(xué)鑒定。

1．3．2 產(chǎn)毒關(guān)鍵基因aflR的PCR鑒定

提取曲霉菌基因組DNA，根據(jù)aflR基因序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物。上游引物為aflR－5'－AACCGCATCCACAATCTCAT－3'，下游引物為aflR－5'－AGTGCAGTTCGCTCA GAACA－3'［13］。

以菌株基因組DNA為模版，采用40μLPCR體系，依次加入:4μL 10×Buffer(不含Mg2+)，2μL(25 mmol/L)MgSO4，4μL(2 mmol/L)dNTPs混合物，上、下游引物各1μL，1μL的DNA模板和1μL KOD－plus－聚合酶，最后加入26μL無菌去離子水。PCR擴(kuò)增條件如下:94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)程序:94℃變性1 min，52℃退火1 min，68℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，再68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入PMD 19－T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序鑒定。測序結(jié)果在Gene Bank中做Blast比對分析。

1．3．3 黃曲霉菌的株固體發(fā)酵培養(yǎng)

將黃曲霉菌株接種于察氏培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d［14］。取平板上的單菌落接種于察氏斜面培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5～6 d。待斜面上布滿黃綠色菌絲，并菌絲上略生孢子時(shí)，用無菌水制成孢子懸液，接種于裝有滅菌大豆培養(yǎng)基的1 000 mL的三角瓶中，再加入無菌蒸餾水混勻，固液比為3:1，置28℃恒溫培養(yǎng)21 d。

1．3．4 黃曲霉毒素的萃取［15－16］

取發(fā)酵產(chǎn)物20 g，加入5 g氯化鈉、100 mL甲醇 －水(55+45)的溶液，于振蕩器上振蕩30 min，用快速定性濾紙過濾，收集濾液。取50 mL濾液，于250 mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入50 mL的正己烷，手動提取約1 min，靜置分層，如有乳化，滴加少許甲醇促使分層，甲醇－水層轉(zhuǎn)移至另一分液漏斗，在分液漏斗中加入50 mL的二氯甲烷，萃取分離。將二氯甲烷層收集到150 mL茄形瓶中，再重復(fù)萃取2次，收集到同一茄形瓶中，氮?dú)獯蹈芍链蠹s3 mL液體。將3 mL液體用多功能凈化柱凈化待測。

1．3．5 黃曲霉毒素檢測的色譜條件

黃曲霉毒分析柱使用Venusil XBP反相C18柱，粒徑:5μm規(guī)格:4．6×250 mm;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:25℃;流動相:甲醇/水(50∶50，體積比);流速:1 mL/mim;熒光檢測器:Ex=360 nm，Em=440 nm;采用AURA光化學(xué)衍生池柱后衍生。

1．3．6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將1μg/mL的AFG1、AFB1和0．3μg/mL的AFG2、AFB2的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋，配成AFG1、AFB1濃度為2、5、10、15、20μg/L;AFG2、AFB2濃度為0．6、1．5、3、4．5、6μg/L的黃曲霉毒素工作溶液。在1．2．5的色譜條件下進(jìn)樣檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2．1 黃曲霉菌株形態(tài)學(xué)鑒定

挑取黃曲霉菌株A．Flavus3．4408、A．Flavus HD-WS、A．Flavus HDWH、A．Flavus ASAG3孢子制片，在40倍熒光顯微鏡下觀察黃曲霉菌株孢子形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定圖

如圖1所示，在40倍熒光顯微鏡下觀察篩選菌株孢子形態(tài)，同時(shí)與黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株3．4408對照，初步鑒定本試驗(yàn)篩選獲得菌株為黃曲霉菌株。

2．2 曲霉菌株aflR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用aflR基因的特異擴(kuò)增引物通過PCR擴(kuò)增，核酸電泳如圖2所示，分析發(fā)現(xiàn)分離菌株得到的aflR基因擴(kuò)增片段與標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增獲得的aflR基因片段大小一致，測序結(jié)果在Gene Bank中做Blast比對分析表明aflR基因相似度達(dá)到99%以上，因此可確定所篩菌株含有黃曲霉毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵基因aflR。

圖2 曲霉菌株aflR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在所選用色譜條件下，黃曲霉毒素得到良好的基線分離，4種毒素在15 min內(nèi)出峰，先后順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2、AFB1，圖3為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

圖3 黃曲霉毒素AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

分別量取已梯度稀釋好的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，其中AFG1、AFB1質(zhì)量濃度為2、5、10、15、20μg/L;AFG2、AFB2濃度為6、4．5、3、1．5、0．6 μg/L的黃曲霉毒素工作溶液，在上述條件下進(jìn)樣檢測，以黃曲霉毒素的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程如表1所示。由表1可知黃曲霉毒素在2～20μg/L和0．6～6μg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好。

表1 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程

2．4 黃曲霉菌株產(chǎn)毒量測定

在本試驗(yàn)條件下，黃曲霉毒素混標(biāo)出峰順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2、AFB1，黃曲霉毒素各組分均可有效分離，各黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素液相色譜圖見圖4。

圖4 黃曲霉菌各菌株液相測定色譜圖

從圖4中可以看出，黃曲霉毒素各組分均可有效分離，4種毒素在15 min內(nèi)出峰。在檢測過程中黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株3．4408的毒素提取液由于產(chǎn)毒量太大做了500倍稀釋，其他菌株提取液均做50倍稀釋。本試驗(yàn)中黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株A．Flavus3．4408和篩選的黃曲霉菌A．Flavus ASAG3和A．Flavus HDWS都有AFG2、AFG1、AFB2、AFB1檢出，黃 曲 霉 菌A．Flavus HDWH檢出只產(chǎn)AFB2、AFB1，而A．Flavus 3．2572沒有黃曲霉毒素檢出。通過HPLC檢測結(jié)果，計(jì)算黃曲霉菌株產(chǎn)毒情況如表2。

表2 黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素含量/μg/kg

黃曲霉菌株在每克大豆培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃曲霉毒素的含量差異很大，由表2可知，黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌A．Flavus3．4408產(chǎn)毒量最高AFG2為536．23μg/kg、AFG1為3 217．5μg/kg、AFB2為279．42μg/kg、AFB1為1 031．28μg/kg，平均達(dá)到每千克培養(yǎng)基產(chǎn)毒量能達(dá)到毫克以上;分離得到的黃曲霉菌株A．Flavus ASAG3產(chǎn)生黃曲霉毒素AFG2為56．3μg/kg、AFG1為613．48μg/kg、AFB2為37．88μg/kg、AFB1為175．77μg/kg;黃曲霉菌株A．Flavus HDWS產(chǎn)生黃曲霉毒素含量較低AFG2為21．37μg/kg、AFG1為167．62μg/kg、AFB2為16．2μg/kg、AFB1為68．66 μg/kg;而黃曲霉菌菌株A．Flavus3．2572則沒有黃曲霉毒素產(chǎn)生。

3 討論與結(jié)論

研究對發(fā)霉糧食中分離得到的三株菌株和中國微生物菌種保藏中心購買得到的兩株黃曲霉菌(3．4408、3．2572)通過形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定分離菌株為黃曲霉菌。由于PCR技術(shù)具有靈敏、特異、快速等特點(diǎn)，本研究采用PCR技術(shù)對分離菌株做進(jìn)一步鑒定。aflR基因在黃曲霉毒素產(chǎn)生過程中具有十分重要的作用，aflR基因的轉(zhuǎn)錄中斷可能抑制其他黃曲霉毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)［9］。本試驗(yàn)所用引物與Somashekar等［13］相同，通過設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增檢測，發(fā)現(xiàn)所分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株中均含有黃曲霉毒素產(chǎn)生關(guān)鍵基因aflR。將測序結(jié)果在Gene Bank中進(jìn)行Blast比對分析表明:試驗(yàn)分離菌株和菌株與FN3981 57．1黃曲霉ITEM 8094和AY510455．1黃曲霉菌株AF36的aflR基因相似度達(dá)到99%以上，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定最終確定所分離菌株為黃曲霉菌株。

HPLC檢測不同黃曲霉菌株的產(chǎn)生黃曲霉毒素毒能力差異時(shí)，由于在線光化學(xué)衍生裝置不需要在流動相中加任何試劑，待測樣品在流經(jīng)光化學(xué)衍生器中被紫外燈管照射的網(wǎng)狀通路時(shí)，解決了AFB1和AFG1在檢測中熒光強(qiáng)度較低的問題，AFB1和AFG1的熒光強(qiáng)度被大大提高，所以本實(shí)驗(yàn)HPLC檢測采用柱后衍生光化學(xué)衍生器。

本研究下一步將繼續(xù)探索影響黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素的原因和機(jī)理。尋求快速鑒別曲霉菌株是否產(chǎn)毒的方法，為糧油食品中潛在產(chǎn)生黃曲霉毒素的菌株鑒別和食品發(fā)酵工業(yè)菌株的選育和安全應(yīng)用提供實(shí)用快速的鑒別技術(shù)。

［1］Eaton D L，Gallagher E P．Mechanisms of Alfatoxin carchinogenesie［J］．Annu Rev Pharmacol Toxicol，1994，34:135－172

［2］Chang P K，Yu J，Bhantagar D，et al．The Carboxy －Terminal Portion of the Aflatoxin Pathway Regulatory Protein AFLR of Aspergillus parasiticus Activates GAL1::lacZ Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae［J］．Applied and Eevironmental Microbiology，1999，65(6):2508－2512

［3］Abbas H K，Weaver MA，Zablotowicz RM，et al．Relationships between aflatoxin production and sclerotia formation among isolates of Aspergillus section Flavi from the Mississippi Delta［J］．European Journalof Plant Patholilogy，2005，112:283 －287

［4］Bhatnagar D，Ehrlich K C，Cleveland TE，et al．Molecular genetic analysis and regulation of aflatoxin biosynthesis［J］．Appl Microbiol Biotechonl，2003，61:83－93

［5］Yu J，Chang P K，Bhatnagar D，et al．Genes encoding cytochrome P450 and monooxygenase enzymes define one end of the aflatoxin pathway gene cluster in Aspergillus parasiticus［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2000，53(5):583－590

［6］Keller NP，Hohn TM．Metabolic pathway gene clusters in filamentous fungi［J］．Fungal Genetics and Biology，1997，21:17－29

［7］Georgianna D R，Payne G A．Genetic regulation of aflatoxin biosynthesis:From gene to genome［J］．Fungal Genetics and Biology，2009，46:113－115

［8］Ehrlich K C，Montalbano BG，Bhatnagar D，et al．Alteration of different domains in AflR affects aflatoxin pathway metabolism in Aspergillus parasiticus transformants［J］．Fungal Genetics and Biology，1998，23:279－287

［9］Cary J W，Ehrlich K C，Wright M，et al．Generation of aflR disruption mutants of Aspergillus parasiticus［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2000，53:680－684

［10］Ehrlich K C，Montalbano B G，Cotty P．J．Sequence comparison of aflR from different Aspergillus spe cies provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production［J］．Fungal Genetics and Biology，2003，38:63－74

［11］Yu J，Chang P K，Cleveland D B E．Cloning and functional expression of an esterase gene in Aspergillus Parasiticus［J］．Mycopathologia，2002，156:227－234

［12］張春艷，周孝治，陳菊芳，等．光化學(xué)衍生－高效液相色譜法測定黃曲霉毒素含量［J］．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，36(5):570－571

［13］Somashekar D，Rati E R，Chandrashekar A．PCR－restriction fragment length analysis of aflR gene for differentiation and detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus inmaize［J］．International Journal of Food Microbiology，2004，93(1):101－107

［14］Brackett R E．Strategies for dealing with aflatoxins in peanuts［M］．Yam T C，Tan C．Trends in Food Product Development．Singapore:Singapore Institute of Food Science and Technology，1989:83－91

［15］程樹峰，唐芳，伍松陵．碘柱前衍生－高效液相色譜法快速測定糧食中黃曲霉毒素［J］．糧油食品科技，2008，16(6):40－55

［16］高秀芬，計(jì)融，李燕俊，等．高效液相色譜法測定玉米中的黃曲霉毒素［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19(2):105－108．

Isolation and Identification of Aspergillus Flavus Strains and Analysis of Toxin－Producing Ability

Yang Shengrui1，2Qu Lingbo1Sun Changpo2Shen Han2Shen Jin3Wu Songling2
(College of Bioengineering，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450001)
(Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037)
(Institute of Agricultural By － p roducts Processing，Chinese Academy of Agricultural Engineering3，Beijing 100026)

Several Aspergillus flavus strains were isolated from moldy grain，then were identified by spore morphological and Molecular Biological Identification．The toxin－producing ability of strains were detected and analyzed by HPLC after fermentation．The results showed that experimental isolated strain were Aspergillus flavus and contains toxigenic key gene of afl;the toxin－producing ability was very different between these Aspergillus flavus strains．Aspergillus flavus 3．4408 produce the hightest aflatoxin while Aspergillus flavus HDWS only produces a little．Even more，Aspergillus flavus 3．2572 could not produce aflatoxin under the same condition;Among aflatoxin－producing strains，some of the strains produce aflatoxin AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，Aspergillus flavus HDWH only produces aflatoxin AFB1，AFB2．

Aspergillus flavus，aflatoxin，aflR gene，HPLC

Q93－31

A

1003－0174(2012)06－0110－06

時(shí)間:2012－04－27 08:44

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120427．0844．001．html

國家科技支撐計(jì)劃(2009BADA0B05)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003077)

2011－12－26

楊生瑞，男，1987年出生，碩士，微生物學(xué)

伍松陵，女，1967年出生，副研究員，生化工程