河南省豬鏈球菌的分離鑒定及血清型分布情況

王宏魁，李清州，毛 薇

（1.鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校，河南 鄭州450011；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究中心，河南 鄭州450002；3.河南省鄭州市鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州450052）

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦炎、流產(chǎn)、多發(fā)性漿膜炎和支氣管肺炎，發(fā)病豬群死亡率可達(dá)80%。該菌分為35個(gè)血清型，其中血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經(jīng)常流行的血清型，與動(dòng)物致病性有很大關(guān)系［1］，其中，以2型危害巨大，人可以感染發(fā)病而導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和永久性耳聾等［2－5］，甚至引起死亡，引起極大的公共衛(wèi)生關(guān)注。本試驗(yàn)于2009年7月至2010年1月，在河南省14個(gè)地市33個(gè)豬場(chǎng)送檢的病豬中無菌采集腭扁桃體樣品83份，進(jìn)行了豬鏈球菌的檢測(cè)及分離鑒定，以期為研制豬鏈球菌新型疫苗和新型檢測(cè)方法提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 2009年7月至2010年1月從河南省不同地市送診的臨床發(fā)病豬體內(nèi)采集腭扁桃體樣品，于－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 參考菌株和主要試劑 參考菌株豬鏈球菌1型SH28，2型S735由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心范偉興教授惠贈(zèng)，豬鏈球菌7型、9型菌株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室分離保存。陰性對(duì)照菌株馬鏈球菌獸疫亞種（C群，CVCC562），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。DL－2 000DNA Marker、rTaqDNA聚合酶，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；BactoTMTodd Hewitt Broth（THB），購(gòu)自 BD 公司；DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 豬鏈球菌的分離鑒定 用無菌接種環(huán)挑取扁桃體樣品劃線接種于綿羊血瓊脂平板，37℃溫箱倒置培養(yǎng)16～20h，挑取單個(gè)疑似菌落再次劃線接種于血平板進(jìn)行純化，經(jīng)革蘭染色鏡檢后，挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接入5mL THB液體培養(yǎng)基（30g／L）中，37℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)16～20h，抽提基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照Smith等［4］介紹的方法，以 GenBank中收錄的豬鏈球菌1（14）、2（1／2）、7、9型型特異的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列（序列號(hào)分別為：AF155804、EF539837、AF164515、AF155805）為參考，利用Primer 5.0和Oligo 6.0分別設(shè)計(jì)4對(duì)引物。豬鏈球菌菌種鑒定引物使用Ogi等［6］公布的引物序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.5 基因組DNA的提取 取200μL菌液于1.5 mL Eppendorf管中，4℃12 000r／min離心1min。棄上清液，加入1mL TE溶液（10mmol／L Tris－HCl，1mmol／L EDTA，pH 值8.0）懸浮洗滌1次。4℃12 000r／min離心1min。棄上清液，加入100 μL TE溶液，重新懸浮。100℃煮沸5min，冷卻至室溫。12 000r／min離心1min。取上清直接PCR或保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增 分兩次PCR進(jìn)行。豬鏈球菌種及其1、2、7型四重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）gdh與cps7H各1.2μL，cpslI與cps2H各1μL、模板 DNA 2 μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加 ddH2O至50μL。豬鏈球菌9型單一PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）各1μL、模板DNA 2μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加ddH2O至50μL。反應(yīng)參數(shù)均為：95℃ 預(yù)變性5min；94℃ 變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。取5μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后在紫外檢測(cè)儀下觀察，并用凝膠成像儀拍照保存。抽取部分豬鏈球菌菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收純化目的基因片段，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬鏈球菌形態(tài)學(xué)觀察 豬鏈球菌均呈針尖狀大小，灰白色或灰色，α溶血（不完全溶血，草綠色溶血環(huán)）、β溶血（透明溶血環(huán)，完全溶血）或γ溶血（不溶血）。其中豬鏈球菌9型PY－2株的形態(tài)灰白色，針尖狀，α溶血。革蘭染色后的豬鏈球菌呈革蘭染色陽性、圓形或卵圓形，成對(duì)或長(zhǎng)、短鏈狀排列。

2.2 豬鏈球菌PCR鑒定 部分菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。分別擴(kuò)增到了大小約689bp、542bp、441bp和232bp的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果相符。

圖1 部分菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證 抽取豬鏈球 菌 NYDZ－3、HBQX－6、ZMDSC－2、ZKXH－2、LY－3、AY－1、HBQX－2、HBQX－1、PY－2、PDSWG－1株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，所有測(cè)序結(jié)果均與預(yù)期一致，測(cè)序結(jié)果已遞交GenBank，登錄號(hào)為GU358478－GU358486和GU223113，從分子水平上驗(yàn)證了該P(yáng)CR的準(zhǔn)確性。

2.4 分離的菌株總結(jié) 結(jié)果表明，在河南14個(gè)地市33個(gè)豬場(chǎng)的83份病豬扁桃體樣品中，有68份豬鏈球菌分離陽性，占81.9%，共分離到豬鏈球菌77株，總分離率為92.8%，其中血清2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他型63株，占75.9%，未分離到1型。分離的菌株以2型為最多，其次是9型和7型。在河南省14個(gè)地市的豬鏈球菌分離株中，有6個(gè)地市分離到血清2型，分別是：駐馬店、平頂山、周口、南陽、洛陽、鶴壁。在安陽、鶴壁和濮陽3個(gè)地市分離到血清7型。在周口、濮陽、鶴壁和濟(jì)源4個(gè)地市分離到血清9型。其中在鶴壁市同時(shí)分離出血清2、7、9三個(gè)型，濮陽市同時(shí)分離出血清7型和9型，周口市同時(shí)分離出血清2型和9型。

3 討論

豬鏈球菌常存在于健康豬和病豬的扁桃體中。健康豬扁桃體的帶菌率為0%～70%，有的甚至高達(dá)100%［6］。李春玲等［7］對(duì)廣東省401個(gè)屠宰豬的調(diào)查結(jié)果為：SS為154份，占38.4%，其中2型17.2%，9型8.7%，7型和l型分別為2.2%和0.7%。本研究采用PCR法從河南14個(gè)地市83只病豬的68只扁桃體內(nèi)共分離檢測(cè)到豬鏈球菌77株，陽性檢出率達(dá)81.9%，分離率為92.8%，其中2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他未知血清型占75.9%，河南省14個(gè)地市中有9個(gè)地市存在豬鏈球菌血清2、7、9型，并且以2型為最多，存在于其中的6個(gè)地市，其次是9型，在4個(gè)地市中分離到，然后是7型，存在于3個(gè)地市，說明在河南省廣泛存在豬鏈球菌及其主要致病型血清2、7、9型。迄今為止，沒有分離到血清1型，說明河南省可能不存在該血清型。

表2 河南省14個(gè)地市病豬腭扁桃體豬鏈球菌的分離情況（份）

河南省豬鏈球菌呈多重感染狀況，多個(gè)血清型或與多個(gè)病原同時(shí)或繼發(fā)感染。在鶴壁某豬場(chǎng)同時(shí)分離到了豬鏈球菌血清2、7、9型，但單一血清型分離自不同豬只。在1份病料中同時(shí)分離到了豬鏈球菌2型及其他2個(gè)未知血清型菌株的樣品有5份，分別自南陽、駐馬店、周口、平頂山、洛陽。在一份病料中同時(shí)分離到了豬鏈球菌9型及其他血清型兩個(gè)菌株的樣品有2份，分別來自濮陽、周口。說明河南省豬場(chǎng)內(nèi)普遍存在多種血清型豬鏈球菌同時(shí)感染的情況。另外，豬鏈球菌與其他病毒和細(xì)菌混合感染普遍存在，分離到豬鏈球菌的豬只大多都有HC、PCV、HPS和MPS單一或二重、甚至三重、四重感染。比如：分離到血清2型豬鏈球菌的7只豬都有HC、PCV單個(gè)或雙重病毒感染、有1只豬存在MPS感染，有2只豬（2只背景不詳除外）呈現(xiàn)豬鏈球菌病的特征性表現(xiàn)，關(guān)節(jié)腫、皮發(fā)紅、偶有神經(jīng)癥狀。

豬鏈球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經(jīng)常流行的血清型，與動(dòng)物致病性有很大關(guān)系［1］。此次分離到的菌株毒力強(qiáng)弱、致病性如何以及在豬只發(fā)病中扮演那種角色，有待于進(jìn)一步研究。目前，河南省尚缺乏豬鏈球菌致病血清2、7、9型的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)闡明了河南省現(xiàn)階段豬鏈球菌不同血清型的流行狀況，為該病的診斷防制以及疫苗的選用提供了新的思路，同時(shí)提供了豐富的背景明確的菌株，方便了下一步生產(chǎn)和科研工作的開展。

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