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    MicroRNA研究方法進(jìn)展

    2012-11-22 03:44:52王平山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局271000
    山東畜牧獸醫(yī) 2012年12期
    關(guān)鍵詞:報(bào)告基因信息學(xué)靶標(biāo)

    王平 (山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000)

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    MicroRNA研究方法進(jìn)展

    王平 (山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000)

    miRNAs是一類內(nèi)源性、約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼RNA,具有穩(wěn)定的特異性序列以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。2001年,miRNAs作為線蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)器而被發(fā)現(xiàn),在病毒、植物和動(dòng)物體中,miRNAs已被公認(rèn)為主要的調(diào)控基因家族之一,通過(guò)mRNA靶向作用降解或抑制其翻譯。

    小RNA在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守,并已被證實(shí)參與和調(diào)控包括時(shí)序發(fā)育、細(xì)胞凋亡脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過(guò)程,以及包括肺癌、白血病在內(nèi)的多種疾病發(fā)生過(guò)程[1]。目前,對(duì)小RNA表達(dá)的鑒定主要依靠以雜交、PCR、生物芯片的方法;對(duì)靶標(biāo)的確定,主要依靠生物信息學(xué)方法;對(duì)其功能線索的獲得,則主要依賴于在特定細(xì)胞或動(dòng)物模型內(nèi)外源性抑制或表達(dá)相應(yīng)的小RNA基因,再通過(guò)報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證后檢測(cè)特定細(xì)胞或動(dòng)物模型發(fā)育過(guò)程中的生化或分子變化來(lái)實(shí)現(xiàn),并同時(shí)利用報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)小RNA的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。在此筆者對(duì)經(jīng)典的及最新發(fā)展的研究小RNA的技術(shù)方法作簡(jiǎn)要的總結(jié)和概述。

    1 miRNA基因鑒定

    1.1 遺傳學(xué)方法

    正向遺傳學(xué)的原理是把突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當(dāng)中分離出來(lái),進(jìn)行研究鑒定。而反向遺傳學(xué)則在體外引入特定的突變,然后把已突變的基因放回到原來(lái)的宿主當(dāng)中,而且常常是通過(guò)同型基因化或換位放回到宿主中原來(lái)的位置上,從而觀察表型的改變。在研究miRNAs的時(shí)候,反向遺傳學(xué)分析方法常常與生物信息學(xué)分析相結(jié)合,對(duì)可能的miRNAs基因進(jìn)行預(yù)測(cè),然后運(yùn)用反向遺傳學(xué)分析方法引進(jìn)突變,觀察表型,從而對(duì)基因進(jìn)行定位。

    1.2 分子生物學(xué)方法

    1.2.1 miRNA克隆 不同的小RNA克隆方法的原理基本一致:首先,通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離RNA片段,回收20-25 ntRNAs。接著,將篩選的RNA分子,連接到3’和5’的適配子上,逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得miRNAs 的cDNA文庫(kù),然后對(duì)這些cDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序,再結(jié)合生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。在進(jìn)行miRNAs和適配子連接前通常要進(jìn)行以下處理:miRNA去磷酸化、合成3’適配子時(shí)把3’末端羥基與非核苷酸基團(tuán)連接,屏蔽羥基、或者在合成3’適配子時(shí)把3’末端在多聚腺苷酸酶的作用下增加poly(A)尾巴[2]。

    1.2.2 Northern雜交 PAGE及隨后的Northern雜交,為小RNA檢測(cè)提供了簡(jiǎn)便而可靠的方法。Northern雜交不僅具有高靈敏的特點(diǎn),還能結(jié)合使用RNA marker檢測(cè)小RNA的分子大小,這對(duì)于排除其它小分子RNA的污染有重要意義。Northern雜交也可作為miRNA定量的方法,只需將已知濃度梯度的寡核苷酸對(duì)照物與待測(cè)樣品進(jìn)行平行雜交即可[3]。

    1.2.3 基因芯片(microarray) 對(duì)miRNAs表達(dá)水平高通量分析的最普遍的方法是使用寡核苷酸微陣列[4],在大樣本的研究中,使用這種方法能夠同時(shí)測(cè)量成百上千miRNAs的基因表達(dá)。另外一種微陣列方法叫作微流引物延伸檢測(cè)Microfluidic Primer Extension Assay(MPEA),這種檢測(cè)方法以Febit Geniom?微陣技術(shù)的使用為基礎(chǔ),miRNA在高度靈敏的微陣列雜交前,不需要標(biāo)記。接著,DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流動(dòng)芯片的通道中,相應(yīng)的miRNA得以特異延伸。此方法將雜交檢測(cè)的特異性與酶延伸的高辨別能力相結(jié)合[5]。

    1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 與雜交方法相比,PCR方法可以高度靈敏地檢測(cè)出低豐度表達(dá)的靶分子,并適于高通量篩選。PCR擴(kuò)增簡(jiǎn)要過(guò)程如下:首先將純化的小分子量RNA與引物混合,經(jīng)變性、復(fù)性過(guò)程使引物與模板配對(duì);然后,加入包含逆轉(zhuǎn)錄酶、底物、DTT以及RNA酶抑制劑的混合物,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA;再以cDNA為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

    2 miRNA靶標(biāo)鑒定

    2.1 計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)

    絕大多數(shù)的miRNAs都是通過(guò)堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū),從而抑制其翻譯,達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。因此靶標(biāo)的鑒定對(duì)研究miRNA的功能至關(guān)重要。隨著生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)在生物研究應(yīng)用的發(fā)展,很多實(shí)驗(yàn)室都建立了靶標(biāo)鑒定的計(jì)算機(jī)方法,計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)具有可靠性、可驗(yàn)證性的優(yōu)點(diǎn)。

    到目前為止,根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)建立了很多計(jì)算機(jī)程序篩選法(附表)。2003年,Stark和同事通過(guò)程序?qū)诟构壢蚪M搜尋鑒定潛在的miRNA靶標(biāo)首先得到成功[6]。

    附表 已建立的靶標(biāo)預(yù)測(cè)方法

    MethodType of methodRefsMethod Availa-bilityData Avail-abilityResource http:// Stark et al.Complementarity[7]Online searchYeswww.russell.embl.de/miRNAs/ miRandaComplementarity[8]DownloadYeswww.microrna.org/ miRanda miRBaseComplementarity[9]Online searchYesmicrorna.sanger.ac.uk/ TargetScan Seedcomplementarity[10]Online searchYeswww.targetscan.org/ DIANAThermodynamics[11]Dow-nloadYesdiana.pcbi.upenn.edu/ PicTarThermodynamics[12] Yespictar.bio.nyu.edu/ RNAHy-bridThermodynamics and statistical model[13]Dow-nload bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ miTargetSVMe[14]Online Search cbit.snu.ac.kr/ miTarget/

    2.2 miR-TRAP技術(shù)

    miR-TRAP技術(shù)是最新發(fā)展的技術(shù)。操作miR-TRAP可分為三個(gè)基本步驟,首先通過(guò)共軛補(bǔ)骨脂素(一種可通過(guò)光激活的植物分子)生成針對(duì)目的miRNA的高度光反應(yīng)探針,第二步完成長(zhǎng)波紫外線光交聯(lián)反應(yīng),第三步拉下(pull down)RNA,并用RT-qPCR對(duì)其進(jìn)行分析。換句話說(shuō),利用紫外線光殺死細(xì)胞,將miRNA/mRNA雙雙冷凍在適當(dāng)?shù)奈恢谩kS后從細(xì)胞中抽提出RNA,可以進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)合mRNA序列,揭示miRNA的靶基因。

    3 miRNA功能的研究

    3.1 小RNA抑制

    目前,主要有兩種方法可以阻斷小RNA的作用:一是敲除小RNA基因或其在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn),二是小RNA的序列特異性抑制。由于分子大小的限制,小RNA基因直接敲除的方法并不實(shí)用。所以,研究者多使用反義寡核苷酸抑制劑來(lái)阻斷小RNA的作用[15-17]。這種抑制劑是體外化學(xué)合成,能與特異性小RNA完全互補(bǔ)的反義RNA。在借助轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入目的細(xì)胞后,能快速并穩(wěn)定地與內(nèi)源性成熟小RNA分子互補(bǔ)結(jié)合,從而阻止了內(nèi)源性小RNA分子與靶基因配對(duì)。

    3.2 小RNA的過(guò)表達(dá)

    與常規(guī)mRNA的功能研究相似,小RNA的過(guò)表達(dá)研究也是研究小RNA功能的一種主要方式??梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)建小RNA表達(dá)載體,或體外直接合成小RNA前體,轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。前者由于可獲得穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)細(xì)胞株而應(yīng)用較為普遍。在前一種方式中,通常先從基因組中擴(kuò)增小RNA基因及其旁側(cè)序列,然后將其克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體,最后感染目的細(xì)胞觀察功能效應(yīng)[18,19]

    3.3 小RNA的報(bào)告基因系統(tǒng)

    小RNA的報(bào)告基因系統(tǒng),是小RNA研究中一種常用的輔助手段,它常被用于檢測(cè)單個(gè)小RNA的抑制情況及驗(yàn)證小RNA的靶基因。當(dāng)使用序列特異的抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)的特異小RNA時(shí),常同時(shí)轉(zhuǎn)入3′UTR區(qū)含有該小RNA互補(bǔ)序列的報(bào)告基因載體,來(lái)驗(yàn)證小RNA的作用是否被阻斷[20]。同樣,為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因是否被小RNA所抑制,可將預(yù)測(cè)靶基因的小RNA互補(bǔ)位點(diǎn)或3′UTR序列克隆入報(bào)告基因序列的下游,然后通過(guò)分析報(bào)告基因的表達(dá)情況,來(lái)驗(yàn)證靶基因預(yù)測(cè)的正確與否[21,22]。

    4 前景和展望

    自從第一個(gè)miRNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái),此類非編碼小RNA成為研究的熱點(diǎn)。短短幾年,miRNA的研究從發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)miRNA分子到了解其功能和作用機(jī)制。近年來(lái)對(duì)miRNA的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展,并且有大量的miRNA被鑒定,許多實(shí)驗(yàn)室都開(kāi)發(fā)了miRNA基因鑒定,靶標(biāo)鑒定計(jì)算機(jī)鑒定方法。miRNA微芯片技術(shù)可以作為實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的手段,但必須有大量的已知miRNA作為基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析技術(shù)是高通量研究miRNA的有效手段,但是結(jié)果具有不確定性,需要常規(guī)分子生物學(xué)方法做輔助驗(yàn)證。在實(shí)際研究中將常規(guī)分子生物學(xué)方法和生物信息學(xué)分析技術(shù)聯(lián)合使用,發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢(shì)。為預(yù)測(cè)更多miRNA,并鑒定其靶標(biāo),確定其功能,需要我們把生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及遺傳學(xué)等學(xué)科的研究方法結(jié)合起來(lái)。

    [1] David P. Bartel. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell, Vol. 116, 281-297.

    [2] FuH, TieY. XuC.,et a1.Identification of human fetal liver miRNAs by a hovelmethod [J].Cancer, 2005,579(17):3849-3854.

    [3] Lim L P , Lau N C , Weinstein E G, et al . The microRNAs of Caenorhabditis elegans[J ] . Genes Dev ,2003 ,17 : 991-1008

    [4] Liu C.G., Calin, G.A., Meloon, B., Gamliel, N., Sevignani, C., Ferracin, M., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Zupo, S., Dono, M., Alder, H., Bullrich F., Negrini M. and Croce C.M. (2004) Proc Natl Acad Sci (26):9740-4.

    [5] Vorwerk, S., Ganter, K., Cheng, Y., Hoheisel, J., St?hler, P.F. and Beier, M. (2008) New Biotechnology 25 in press.

    [6] Chen C , Ridzon D A , Broomer A J , et al . Real2time quantification of microRNAs by stem2loop RT2PCR[J ] . Nucleic Acids Res , 2005 , 33(20) : e179.

    [7] Stark A..Brennecke J.,Russekk , et a1.Identification of Drosophila microRNA targets.PLoS Biol,2003,1(3): 144.

    [8] Rehmsmeier M. ,Steffen P. ,Hochsmann M. ,et aI, Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. 10(10): l507-1517.

    [9] Stark, A. et al.Identification of Drosophila microRNA targets. PLoS Biol. 2003, 1: E60.

    [10] Enright, A.J. et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biol.2003, 5: R1.

    [11] Griffiths-Jones, S. et al. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 2006, 34 (Database issue): 140–144.

    [12] Lewis, B.P. et al. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 2003, 11: 787–798.

    [13] Kiriakidou, M. et al. A combined computational–experimental approach predicts human microRNA targets. Genes Dev. 2006, 18: 1165–1178.

    [14] Krek, A. et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat. Genet. 2005, 3: 495–500.

    [15] Rehmsmeier. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 2004,10: 1507–1517.

    [16] Kim, S.-K. et al. MiTarget: microRNA target gene prediction using a support vector machine. BMC Bioinformatics. 2006, 7: 411.

    [17] Esau C, Kang X, Peralta E, et al. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation. J Biol Chem, 2004, 279 :52361-52365.

    [18] Meister G, Landthaler M, Dorsett Y, et al . Sequence2specific inhibition of microRNA2 and siRNA2 induced RNA silencing [J] . RNA , 2004 , 10 : 544-550.

    [19] Hutvagner G, Simard M J , Mello C C , et al . Sequence2specific inhibition of small RNA function[J] . PLoS Biol , 2004 , 2 (4) : E98.

    [20 ] Zeng Y, Cai X, Cullen B R. Use of RNA polymerase Ⅱ to transcribe artificial microRNAs[J ] . Methods Enzymol , 2005 , 392 :371-380.

    [21] Cimmino A , Calin G A , Fabbri M, et al . miR215 and miR216 induce apoptosis by targeting BCL2 [J] . Proc Natl Acad Sci USA , 2005 , 102 (39) : 13944-13949.

    [22] Cheng A M, Byrom M W, Shelton J , et al . Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis[J]. Nucleic Acids Res, 2005 , 33 (4) : 1290-1297.

    (2012–09–05)

    S813.3

    A

    1007-1733(2012)12-0084-03

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