茶多糖的分離純化及其抗凝血活性*

謝亮亮，蔡為榮，張虹，陳勇

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂及其引發(fā)的血栓性疾病已日益危害人們健康［1］。肝素多糖已在血栓性疾病治療中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用，但易誘發(fā)血小板減少等副作用［2］，從天然產(chǎn)物中尋找抗凝血活性成分，或?qū)⑵渲鹘Y(jié)構(gòu)作為先導(dǎo)化合物進(jìn)而研發(fā)新藥，或開發(fā)功能性食品，具有毒性小、研發(fā)費(fèi)用低、周期短和全民保健的優(yōu)勢(shì)［3］。

茶葉起源于中國(guó)，是古代文獻(xiàn)記載最早的天然藥物之一。在我國(guó)和日本民間有常飲用粗老茶來治療糖尿病的經(jīng)驗(yàn)［4］。而我國(guó)茶葉年產(chǎn)量60萬t左右，其中粗老茶約10萬t，在市場(chǎng)上中低檔茶嚴(yán)重滯銷，在茶葉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量低質(zhì)茶葉，由于喪失飲用價(jià)值而被廢棄，茶葉功能活性的開發(fā)研究已受人們關(guān)注［5］。清水岑夫從番茶中冷水浸提的茶多糖(tea polysaccharides，TPS)具有降血糖效果，是由葡萄糖、D-核糖、阿拉伯糖組成。Takeo報(bào)道有降糖作用的茶多糖由半乳葡聚糖組成。聶少平報(bào)道［6］冷水與沸水提取的粗茶多糖清除DPPH自由基相差數(shù)倍。Monbe等［7］發(fā)現(xiàn)，茶多糖可以明顯增加HL60細(xì)胞的免疫能力。顯示出茶多糖具有多種生理功能，原料及提取分離純化技術(shù)的不同，制得的茶多糖組分、結(jié)構(gòu)及生理活性有所差異。目前報(bào)道的具有抗凝血多糖多為來源于海藻的硫酸化多糖，從粗老茶葉末中提取多糖及抗凝血活性研究報(bào)道甚少。因此，本文選取中低檔茶葉末，提取其多糖，分離純化，進(jìn)而研究了其組成，及抗凝血活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗茶葉末，購(gòu)于蕪湖老三屆茶行;聚酰胺(80～100目)，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠;DEAE Sepharose CL－6B，Pharmacia公司;透析袋，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;Dextran T系列，Pharmacia公司，色譜純;考馬斯亮藍(lán)(G－250)，Sigma公司;APTT、PT和TT試劑盒，上海太陽生物科技有限公司;濃硫酸、苯酚、無水乙醇、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TH－1000梯度混合器、HL－1S恒流泵、BS－100A自動(dòng)部分收集器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52，上海青浦滬西儀器廠;層析柱，江陰市新輝層析設(shè)備有限公司;HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司;IRPretige-21傅立葉變換紅外光譜儀、UV－3600紫外可見分光光度計(jì)，日本島津;Waters 600高效液相色譜儀，配2410示差折光檢測(cè)器及Empower工作站，美國(guó)Waters公司;Sysmex CA－1500凝血儀，日本Symex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多糖的提取

采用水提醇沉［8］提取茶多糖，條件為料液比1∶20，溫度60℃，時(shí)間90 min。提取液過濾除去雜質(zhì)后濃縮，濃縮到原體積的1/5緩緩加入無水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到80%，醇沉24 h后離心去除上清液，冷凍干燥得粗多糖(crude tea polysaccharides，CTPS)。

圖1 茶多糖提取流程圖

1.2.2 粗茶多糖的脫色去蛋白

稱取1 g粗多糖溶于50 mL蒸餾水中，經(jīng)時(shí)間為10 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心后上聚酰胺柱(2.6 cm×60 cm)，以蒸餾水為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，每管收集4 mL，用苯酚-硫酸法［9］跟蹤檢測(cè)，在420 nm［10］下測(cè)量多糖溶液的吸光度確定多糖的脫色率，考馬斯亮藍(lán)G250比色法［11］測(cè)定蛋白含量及蛋白去除率。

式中:OD脫色前、OD脫色后分別為脫色前后茶多糖溶液在420 nm的吸光度。

式中:m去除前、m去除后分別為多糖脫蛋白前后溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

式中:m糖1、m糖2分別是脫蛋白前后的多糖質(zhì)量。

1.2.3 茶多糖的紫外可見和紅外光譜分析

取100 μg/mL 茶多糖水溶液在 200～700 nm［12］內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，觀察紫外可見光譜特征。稱取2 mg多糖樣品，采用KBr研磨壓片，用 IRPretige－21傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm－1區(qū)間［13］內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，觀察其紅外光譜特征。

1.2.4 茶多糖的分離純化

取100 mg茶多糖溶于20 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L，pH 5.9)，離心除去不溶物，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，時(shí)間為10 min，取上清液上離子交換層析柱(1.6 cm×60 cm)，分別用pH 5.9的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.1～0.5 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，流速為2 mL/min，每管收集10 mL，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)。

1.2.5 分子量的測(cè)定

用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)［14］測(cè)定分離純化后的茶多糖樣品，色譜條件為色譜柱:UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.9 mL/min;柱溫:45℃。樣品溶于流動(dòng)相，用0.45 μm微孔膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.6 茶多糖的體外抗凝血

新鮮靜脈血與3.2%的檸檬酸鈉按體積比9∶1混合均勻，以4 000 r/min離心10 min。多糖樣品和血漿按1∶4的體積比進(jìn)行混合，活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法和步驟按照試劑盒和儀器說明進(jìn)行，以肝素鈉和生理鹽水代替待測(cè)樣品分別作為陽性和陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶多糖的提取與純化

按1.2.1法，將200 g茶葉粉末經(jīng)水提、過濾、乙醇沉淀后得茶葉粗多糖6.702 g，提取率為3.351%。制得的CTPS呈棕褐色，示含色素及蛋白質(zhì)，經(jīng)1.2.2法脫色去蛋白。茶多糖聚酰胺柱洗脫曲線(圖2)顯示，前40管吸光度很小，40～100管有吸收，收集40～100管的液體，經(jīng)濃縮、醇沉、冷凍干燥后得到白色的茶多糖(D-TPS)。脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為75.1%、91.2%和79.2%，表明聚酰胺對(duì)茶多糖基本沒有吸附作用，聚酰胺具有脫色、脫蛋白的雙重功效。紫外光譜圖顯示(圖3)，在260～280 nm時(shí)D-TPS比TPS吸光度明顯下降，仍有較寬的特征吸收峰，表明多糖含有蛋白質(zhì)。

圖2 茶多糖聚酰胺柱洗脫曲線

圖3 茶多糖的紫外可見光譜圖

茶多糖的紅外光譜圖(圖4)顯示，D-TPS在3 600～3 200 cm－1區(qū)間出現(xiàn)一種O—H的伸縮振動(dòng)寬峰，3 000～2 800 cm－1出現(xiàn)糖類特征吸收峰C—H，1 665～1 635 cm－1的特征吸收峰表明多糖帶有結(jié)晶水，此外在1 653 cm－1出現(xiàn)多糖中乙酰氨基的C O伸縮振動(dòng)，說明多糖中含有氨基酸殘基，在1 400～1 200 cm－1所看到的不太尖的吸收峰是C—H的變角振動(dòng)，1 200～1 000 cm－1間較大的吸收峰是由一種屬于C—O—H和另一種糖環(huán)的C—O—C的2種C—O伸縮振動(dòng)所引起的，795 cm－1的特征吸收峰則表明茶多糖是呋喃型多糖。

圖4 D-TPS紅外光譜圖

以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的茶多糖洗脫曲線(圖5)，采用DEAE Sepharose CL－6B離子交換柱對(duì)茶多糖進(jìn)行分離純化，經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L，pH 5.9)、0.1、0.2、0.5 mol/L 的 NaCl溶液階段梯度洗脫后得到4個(gè)吸收峰，分別合并收集主峰洗脫液，然后濃縮、透析72h、冷凍干燥后得到白色絮狀固體，分別為 TPS-1、TPS-2、TPS-3、TPS-4。得率分別為13.4%、27.4%、15.9%和17.1%，總的多糖回收率為73.8%。結(jié)合離子交換和NaCl濃度可以得出這樣結(jié)論，TPS-1為中性糖，TPS-2、TPS-3和TPS-4為酸性多糖，而且所帶電荷量在不斷遞增。

圖5 茶多糖DEAE Sepharose CL-6B柱層析洗脫曲線圖

2.2 純度鑒定與分子量分布

HPGPC是按分子篩原理進(jìn)行分離的，不僅可以檢測(cè)多糖的純度，同時(shí)可以測(cè)定多糖的分子量及其分布。經(jīng)GPC軟件處理，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)Log Mol Wt對(duì)保留時(shí)間(retention time)進(jìn)行回歸，其葡聚糖Dextran系列標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線方程為L(zhǎng)og Mol Wt=12.14－0.392tR(tR為保留時(shí)間)，相關(guān)系數(shù)r=0.995 0。茶多糖4個(gè)組分的高效凝膠滲透色譜如圖6，其分析結(jié)果見表1。TPS-1、TPS-2和TPS-3均為單一峰，表明其為均一多糖，其分子量分別為20 760、24 230和250 643。TPS-4的HPGPC圖譜顯示出兩個(gè)峰，可見TPS-4多糖中主要含有2個(gè)組分，其分子量分別為689 113和4 150，表明TPS-4為非均一多糖，因此需進(jìn)一步用凝膠過濾色譜對(duì)其分離。所得茶多糖的分子量與之前報(bào)道不一樣［15－16］，可能與茶多糖的原料和提取方法不一致有關(guān)。

圖6 TPS-1、TPS-2、TPS-3 和 TPS-4 高效凝膠滲透色譜圖

2.3 多糖的體外抗凝血活性

在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，APTT、PT和TT 3項(xiàng)指標(biāo)常常用于確定血液凝固的途徑，APTT是測(cè)定內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況和共同途徑的篩選實(shí)驗(yàn)，PT是測(cè)定外源性凝血狀況的篩選實(shí)驗(yàn)，TT是測(cè)定血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白能力的篩選實(shí)驗(yàn)。采用Minitab 15軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，APTT、PT、TT檢測(cè)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性差異采用t－配對(duì)分析。從茶多糖體外抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，茶多糖及其各個(gè)組分都可以延長(zhǎng)APTT時(shí)間，但各組分對(duì)PT基本沒有影響。其中TPS-4可以顯著的增加APTT和TT的時(shí)間，分別延長(zhǎng)了24.2%和22.8%，表明茶多糖TPS-4是通過內(nèi)源性、共同途徑以及具有把纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白來影響凝血過程的。

表1 茶多糖的高效凝膠滲透色譜結(jié)果

表2 多糖的體外抗凝血活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

(1)在茶多糖的提取過程中用聚酰胺對(duì)多糖進(jìn)行脫色脫蛋白，其脫色率、蛋白去除率和多糖保留率分別為75.1%、91.2%和79.2%，能夠有效的脫色和去除溶液中的蛋白質(zhì)。紅外譜圖顯示D-TPS有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，茶多糖的全波長(zhǎng)掃描表明茶多糖帶有氨基酸殘基。

(2)茶多糖經(jīng)DEAE Sepharose CL－6B離子交換柱分級(jí)純化后得到4個(gè)組分，分別為TPS-1、TPS-2、TPS-3、TPS-4，得率分別為 13.4%、27.4%、15.9% 和17.1%，多糖的總回收率為73.8%，其中TPS-1、TPS-2、TPS-3為單一對(duì)稱峰，分子量分別為20 760、24 230和250 643，為均一多糖，TPS-4含有2個(gè)組分，其分子量為689 113和4 150，為非均一多糖。

(3)體外抗凝血實(shí)驗(yàn)顯示多糖各個(gè)組分都可以延長(zhǎng)APTT時(shí)間，但對(duì)PT沒有影響，其中TPS-4可以顯著延長(zhǎng)APTT和TT時(shí)間，分別延長(zhǎng)了24.2%和22.8%，表明TPS-4具有抗凝血效果。

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